Uma vez que as α-galactosidases extra e intracelulares de D. hansenii foram capazes de hidrolisar rafinose e estaquiose, essas enzimas livres e a enzima extracelular imobilizada foram testadas na redução dos oligossacarídeos de rafinose (RO) presentes no leite de soja.
6 Hidrólise de RO utilizando a α-galactosidase extracelular purificada
No ensaio com a enzima α-galactosidase extracelular, a hidrólise de RO presentes no leite de soja foi realizada conforme descrição no item 3.14, seguido da extração de RO (item 3.16) e análise de RO por CLAE (item 3.17). A eficiência da hidrólise foi avaliada pela redução dos níveis dos RO presentes no leite de soja, em função do tempo de incubação com a enzima. Como controle, o leite de soja foi incubado com igual volume de água destilada, em substituição à enzima purificada, nas mesmas condições.
Os resultados estão apresentados na Figura 68 e os valores das porcentagens de redução dos açúcares solúveis estão mostrados na Tabela 13.
Figura 68 - Cromatograma comparativo da hidrólise de RO do leite de soja pela enzima α-galactosidase extracelular de Debaryomyces
hansenii nos tempos 0 h (A), 2 h (B) e 4 h (C).
Rafinose Estaquiose
A
B
C
Tempo (min) Rafinose EstaquioseA
B
C
Tempo (min)Tabela 13 - Porcentagem de hidrólise de RO no leite de soja pela α- galactosidase extracelular de Debaryomyces hansenii.
Tempo de hidrólise
(h) Rafinose Estaquiose Redução (%)
0 0 0
2 24 100
4 100 100
Os teores de rafinose e estaquiose no tempo 0 h de hidrólise foram considerados como 100 %. Os demais resultados foram calculados em relação ao tempo 0 h, a partir de cromatogramas obtidos das análises por CLAE.
Segundo os dados apresentados na Tabela 13 a enzima α-galactosidase extracelular de D. hansenii apresentou alta atividade sobre os RO, confirmando o seu potencial uso na redução dos teores desses açúcares no leite de soja. Foi verificado que os teores de rafinose e estaquiose foram completamente reduzidos, após 4 h de incubação do leite de soja com 10,5 U de enzima. Resultado semelhante foi obtido com a α-galactosidase S1 do fungo
Aspergillus terreus, porém, com uma maior quantidade da enzima, 40 U (REIS et al., 2004). Ensaios realizados com a α-galactosidase do fungo transformante Penicillium griseoroseum Pg/644, também com 40 U da enzima, mostraram
que o tratamento enzimático reduziu 74 % dos teores de rafinose e 100 % dos teores de estaquiose presentes no leite de soja, após 6 h, a 40 oC (FALKOSKI
et al., 2004).
Guimarães et al. (2001) conseguiram reduzir os teores de rafinose e estaquiose em 67 e 53 %, respectivamente, após tratamento do leite de soja por 12 h, a 30 °C, com a α-galactosidase (1,2 U de enzima por mL de leite de soja não desengordurado) parcialmente purificada de sementes de soja em germinação. Callegari (2003), trabalhando com α-galactosidase semipurificada de soja da variedade Monarca, observou uma redução dos teores de rafinose e estaquiose de 100 e 53 %, respectivamente, após 8 h de incubação, a 40 oC.
A α-galactosidase extracelular de D. hansenii mostrou ser mais eficiente na hidrólise dos oligossacarídeos presentes no leite de soja, comparada às α- galactosidases dos fungos transformante Penicillium griseoroseum Pg/644,
Aspergillus terreus e das sementes germinadas de soja. Esses resultados
indicam que a α-galactosidase extracelular de D. hansenii pode ser usada no desenvolvimento de um processo, com a finalidade de melhorar o valor nutricional do leite de soja, aumentando com isso, o consumo deste produto.
Mulimani; Thippeswamy; Ramalingam (1997), utilizando extrato bruto de
α-galactosidase de sementes de guar, conseguiram obter uma hidrólise dos oligossacarídeos da farinha de soja de 90 % da rafinose e 92 % da estaquiose. Cruz; Batistela; Wosacki (1981) observaram que a α-galactosidase não purificada produzida por Cladosporium cladosporioides hidrolisou
completamente os oligossacarídeos presentes em amostras de leite de soja. As
α-galactosidases não purificadas de Cladosporium cladosporiodes, Aspergillus
orizyae e Aspergillus niger, testadas por Mansour; Khalil (1998) foram
eficientes na redução dos teores de rafinose e estaquiose, presentes na farinha de grão-de-bico. Entretanto, segundo Guimarães et al. (2001), a hidrólise dos RO pode ser realizada pela α-galactosidase, que cliva as ligações α-1,6 dos oligossacarídeos, liberando galactose e sacarose e, pode ser realizada também pela invertase, que cliva as ligações α-1,2, produzindo frutose e melibiose. Com isso, os resultados de hidrólise obtidos por Mulimani; Thippeswamy; Ramalingam (1997); Cruz; Batistela; Wosacki (1981); Mansour; Khalil (1998), utilizando extrato não purificado de α-galactosidases, poderiam ter sido decorrentes da ação dessa enzima, mas também da ação de invertases que poderiam estar presentes no extrato bruto.
6 Hidrólise dos RO utilizando células permeabilizadas de Debaryomyces
hansenii, contendo a α-galactosidase intracelular.
Uma vez que, a enzima α-galactosidase extracelular livre foi capaz de hidrolisar os RO presentes no leite de soja, foram realizados testes de hidrólise com as células permeabilizadas de D. hansenii, contendo a enzima α- galactosidase intracelular.
No ensaio com as células permeabilizadas de D. hansenii, a hidrólise de RO foi realizada conforme descrito no item 3.14, seguido da extração de RO (item 3.16) e análise de RO por CLAE (item 3.17). A eficiência da hidrólise foi avaliada pela redução dos níveis dos RO presentes no leite de soja, em função
do tempo de incubação com a enzima. Como controle, o leite de soja foi incubado com igual volume de água destilada, em substituição à enzima, nas mesmas condições.
Os resultados estão apresentados na Figura 69 e os valores das porcentagens de redução dos açúcares solúveis estão mostrados na Tabela 14.
O tratamento utilizando células permeabilizadas de D. hansenii contendo a α-galactosidase intracelular permitiu a redução de 70 % dos teores de rafinose e 100 % dos teores de estaquiose presentes no leite de soja, após 6 h de incubação a 60 oC (Tabela 14). Como as células foram permeabilizadas,
provavelmente ocorreu o transporte dos substratos rafinose e estaquiose presentes no leite de soja para o interior das mesmas, sendo estes hidrolisados pelas enzimas intracelulares específicas como α-galactosidase e possivelmente invertase e, os produtos liberados no meio.
Em estudos do catabolismo da rafinose em Escherichia coli K12, bactéria capaz de crescer em meio contendo rafinose como única fonte de carbono, Schmid; Schmitt (1976) afirmaram que a utilização desse trissacarídeo depende de um sistema de transporte e das enzimas invertase e
α-galactosidase. Além disso, a síntese e a regulação dessas enzimas foram exercidas pelo plasmídeo Raf D1021. Estudos subseqüentes realizados por Aslanidis; Schimitt (1990) estabeleceram um modelo para o metabolismo da rafinose, onde os genes codificantes para os produtos envolvidos nesse metabolismo estão organizados em um operon. De acordo com esse modelo, a rafinose é transportada para o interior da célula por uma permease, sendo degradada pela ação seqüencial de uma α-galactosidase e uma invertase, ambas enzimas intracelulares.
No processo de hidrólise dos RO presentes no leite de soja, a vantagem da utilização das próprias células de D. hansenii, uma levedura utilizada no processamento de alimentos, sendo portanto não patogênica, é que elimina as etapas de extração e purificação da enzima α-galactosidase intracelular. Isto poderia aumentar a praticidade do processo, gerando economia de tempo e de custos.
Figura 69 - Cromatograma comparativo da hidrólise de RO do leite de soja utilizando células permeabilizadas de Debaryomyces hansenii contendo a α-galactosidase intracelular, nos tempos 0 h (A), 2 h (B), 4 h (C) e 6 h (D).
A
Rafinose EstaquioseB
C
D
Tempo (min)A
Rafinose EstaquioseB
C
D
Tempo (min)Tabela 14 - Porcentagem de hidrólise de RO no leite de soja utilizando células permeabilizadas de Debaryomyces hansenii contendo a α- galactosidase intracelular.
Tempo de hidrólise
(h) Rafinose Estaquiose Redução (%)
0 0 0
2 52 100
4 65 100
6 70 100
Os teores de rafinose e estaquiose no tempo 0 h de hidrólise foram considerados como 100 %. Os demais resultados foram calculados em relação ao tempo 0 h, a partir de cromatogramas obtidos das análises por CLAE.
Comparando-se a eficiência de hidrólise das enzimas extra e intracelulares de D. hansenii foi observado que, a primeira reduziu completamente os teores de rafinose e estaquiose presentes no leite de soja, após 4 h de incubação (Figura 68 e Tabela 13), enquanto que, a utilização das células permeabilizadas de D. hansenii contendo a enzima intracelular reduziu 52 e 100 % os teores de rafinose e estaquiose, respectivamente, nesse mesmo tempo (Figura 69 e tabela 14), e possivelmente com ação da enzima invertase. Apesar da maior eficiência de hidrólise dos RO exibida pela α-galactosidase extracelular purificada, a utilização das células permeabilizadas apresenta vantagens de custo e tempo. Portanto, modificações nas condições de uso das células poderia ser estudada, visando otimização do processo e eficiência comparável ao uso da enzima purificada.
6 Hidrólise dos RO utilizando a α-galactosidase extracelular imobilizada
Os ensaios de hidrólise com a α-galactosidase extracelular imobilizada foram realizados conforme descrição no item 3.14 e os demais procedimentos foram realizados como descrito anteriormente para a α-galactosidase extracelular.
Os resultados estão apresentados na Figura 70 e os valores das porcentagens de redução dos RO estão descritos na Tabela 15.
Figura 70 - Cromatograma comparativo da hidrólise de RO do leite de soja pela α-galactosidase extracelular imobilizada de Debaryomyces
hansenii, nos tempos 0 h (A), 2 h (B), 4 h (C) e 10 h (D).
Rafinose Estaquiose
A
B
C
D
Tempo (min) Rafinose EstaquioseA
B
C
D
Tempo (min)Tabela 15 - Porcentagem de hidrólise de RO no leite de soja pela α- galactosidase extracelular imobilizada de Debaryomyces
hansenii.
Tempo de hidrólise
(h) Rafinose Estaquiose Redução (%)
0 0 0
2 0 88
4 25 100
10 63 100
Os teores de rafinose e estaquiose no tempo 0 h de hidrólise foram considerados como 100 %. Os demais resultados foram calculados em relação ao tempo 0 h, a partir de cromatogramas obtidos das análises por CLAE.
De acordo com os dados da Tabela 15 foi verificado que a enzima imobilizada hidrolisou completamente os teores de estaquiose presentes no leite de soja, após 4 h de incubação. Já a enzima livre, hidrolisou esse oligossacarídeo após 2 h de incubação (Figura 68 e Tabela 13). Com relação ao oligossacarídeo rafinose, a enzima imobilizada reduziu 63 % dos teores desse açúcar presente no leite de soja, após 10 h de incubação, enquanto que após 4 h de incubação, houve hidrólise completa desse RO pela enzima livre.
A enzima imobilizada necessitou de um tempo maior para hidrolisar os oligossacarídeos presentes no leite de soja, comparada com a enzima livre. Esses resultados indicam que o processo de imobilização poderia ter provocado uma perda da afinidade da enzima pelo substrato. Vários trabalhos corroboram esta afirmação (ERGINER et al., 2000; AHMAD; ANSWAR; SALEEMUDIDIN; TONRISEVEN; DOGAN, 2001). Essa perda de afinidade da enzima pelo substrato pode ser devida a alterações físicas e eletrostáticas provocadas pela ligação covalente das proteínas ao suporte. Outro fator de extrema importância que poderia explicar estas alterações é a difusão restrita do substrato através do complexo enzimático (ERGINER et al., 2000).
Thippeswamy; Mulimani (2002), estudando hidrólise enzimática de RO presentes no leite de soja, pela α-galactosidase imobilizada e livre de
Gibberella fujikuroi, verificaram que as enzimas livre e imobilizada hidrolisaram
mostrado maior eficiência catalítica após 12 h de incubação, a imobilização permitiu a reutilização da enzima por várias vezes, enquanto que, a enzima livre foi sempre perdida após a realização dos ensaios.