Os resultados da Fig. 4 nos trouxeram o questionamento se a ligação da rNTPDase ao macrófago poderia reduzir a capacidade fagocítica dessa célula, o que explicaria a redução na penetração de parasitos em macrófagos previamente tratados com rNTPDase. Para avaliar se a NTPDase tem alguma função na alteração da capacidade fagocítica dos macrófagos, as células foram pré-incubadas por 30 minutos com rNTPDase e então incubadas por 2 horas com beads de látex ligados a FITC para avaliação posterior em citômetro de fluxo. Os resultados demonstram que a rNTPDase é capaz de reduzir a capacidade fagocítica do macrófago. Observa-se uma redução da média de intensidade de fluorescência do macrófago tratado com 5µg de rNTPDase (Fig. 9A). Além disso observa-se que redução nas células positivas para FITC (Fig. 9B). Logo, conclui-se que menos células foram capazes de fagocitar os beads de latex após a incubação com rNTPDase e, mesmo as que fagocitaram, tiveram número reduzido de beads no seu interior.
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Os dados demonstram que após 30 minutos de incubação, o macrófago perde em parte sua capacidade de fagocitose. Isso sugere que a rNTPDase, após algum tempo, pode ter um papel importante em desligar as funções básicas de fagocitose do macrófago, contribuindo assim, mais uma vez, para o estabelecimento da infecção. Um único experimento foi realizado utilizando rNTPDase no mesmo momento da incubação dos beads e o resultado preliminar mostra que nesse caso a enzima não é capaz de
A
B
Fig. 9: Pré-incubação com rNTPDase reduz a capacidade fagocítica de macrófagos. Macrófagos peritoneais foram pré-incubados com rNTPDase por 30 minutos e, então, incubados com beads de létex ligados a FITC por 2 horas e analisados por citometria de fluxo. (A) Média de Intensidade de Fluorescência dos macrófagos. (B) Histograma de dois experimentos independentes de células marcadas com FITC ( cinza – células sem marcação / azul – controle positivo / vermelho – células préincubadas com rNTPDase) * p<0.05 Teste t.
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alterar a capacidade fagocítica dos macrófagos (dado não mostrado). Isso é importante, pois a inibição da fagocitose no início do processo não seria interessante para o parasito. Sugere-se, assim, que a e-NTPDase só é capaz de alterar resposta fagocítica após entrada da enzima no macrófago, o que, no caso da infecção pelo parasito, só ocorre concomitante a entrada do parasito. Outros resultados preliminares indicam uma redução na expressão de CD11b em macrófagos incubados com rNTPDase. Sugere-se que o CD11b seja internalizado junto com a enzima, podendo ser, inclusive, um dos receptores para e-NTPDase no macrófago. Sabe-se da importância do CD11b junto com o CD18 como complexo Mac-1 envolvido na fagocitose de partículas (Rosenthal e cols., 1996; Mosser e Brittingham , 1997; Ehlers, 2000). Já foi demonstrado que a expressão do complexo CD11b/CD18 é reduzida em infecção experimental com promastigota de Leishmania, o que indica que esse complexo pode ser internalizado junto com o parasito (Gonçalves e cols., 2005). Podemos sugerir, assim, que a internalização do CD11b junto com a NTPDase pode ser um dos possíveis macanismos de redução da capacidade fagocítica de macrófagos infectados com Leishmania.
O conjunto de dados obtidos nos permite propor que a e-NTPDase de Leishmania é uma molécula importante na adesão à célula hospedeira. Os dados mostraram que o bloqueio da enzima e a tentativa de modulação da expressão da mesma são capazes de alterar a adesão do parasito à macrofágos e, consequentemente, a internalização desses. Essa enzima está, ainda, associada à uma redução da capacidade microbicida do macrófago, de forma a alterar a produção de NO e citocinas pelo macrófago. Além de observamos uma redução do NO, nossos dados indicam redução na produção de IL-12 e IL-10 e uma significativo aumento de TGF-β. De alguma forma, a presença de e-NTPDase na superfície do parasito é um fator importante na subversão da resposta imune. A ligação e possível internalização da e-NTPDase pelo macrófago é capaz, ainda, de alterar a capacidade fagocítica dessas células, o que nos leva a sugerir que a presença dessa enzima é potente em alterar as funções mais básicas do macrófago. Nossas perspectivas são descobrir o ligante para e-NTPDase nas células e entender como essas alterações na capacidade macrofágica acontecem. Sugerimos que a e- NTPDase liga-se a CD11b, se internalizando junto com ele, o que explicaria a redução na capacidade fagocítica das células após incubação com rNTPDase. Dentro do macrófago, acreditamos que a e-NTPDase é capaz de alterar a produção de citocinas e NO por envolvimento direto em mecanismos de sinal de transdução envolvendo citocinas, como os de proteína quinase C (PKC), tirosina quinase e JAK/STAT, ligadas
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à produção de IL-12, fagocitose, expressão de MHC II e moléculas co-estimuladoras e produção de ROS (Denkers & Butcher, 2005). Essa proposta de mecanismo será investigada futuramente.
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SUMÁRIO DE
RESULTADOS
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1. A incubação de Leishmania com anticorpo anti-NTPDase reduz a capacidade de adesão dos parasitos em macrófagos.
2. Leishmania crescida em suramina possui maior capacidade de aderir e internalizar em macrófagos, enquanto que Leishmania crescida em adenina tem essa capacidade reduzida.
3. A competição de rNTPDase com Leishmania pelo um possível receptor da enzima em macrófago reduz a capacidade de adesão e internalização dos parasitos.
4. A incubação de macrófagos com rNTPDase reduz a produção de NO por essas células
5. A incubação de macrófagos com rNTPDase reduz a produção de IL-12 e IL-10 e aumenta a produção de TGF-β por essas células
6. A pré-incubação de macrófagos com rNTPDase por 30 minutos reduz a capacidade fagocítica dessas células.
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Conclui-se com esse trabalho que a e-NTPDase de Leishmania é uma importante molécula envolvida na adesão e consequente internalização do parasito por macrófagos e, além disso, a enzima tem papel na modulação da resposta macrofágica de forma a reduzir a capacidade leishmanicida do macrófago, favorecendo o estabelecimento da infecção.
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