2. TAUSHETSPLIKTBESTEMMELSENES PERSONKRETS
2.5 F INANSFORETAK
• Aplicar 15 µL 0,1N NaOH nas células designadas (colunas 1, 5 e 9) na placa WG#1 AMP2.
• Aplicar 15 µL de amostra de DNA em cada célula contendo NaOH. • Incubar por 10 minutos em ar ambiente.
• Aplicar 270 µL da solução WG#MP1 em cada célula contendo as amostras. • Aplicar 300 µL da solução WG#AMM em cada célula contendo amostras. • Selar a placa WG#1 AMP2.
• Inverter a placa selada por 10 minutos para misturar o conteúdo, centrifugar em pulso em 280 Xg.
• Incubar a placa WG#1 AMP2 no Illumina Hyb Oven por 20 horas (máximo de 24 horas) a 37°C.
3.5.1.2 Fragmentar AMP2
• Remover a placa do forno e centrifugar a 50 Xg por um minuto.
• Dividir as amostras nas três células adicionais, para um total de quatro
células por amostra, cada uma contendo 150 µL (FIG. 3).
• Adicionar 50 µL da solução WG# FRG em cada célula de WG #1 AMP2. • Selar a placa, colocá-la no vórtex a 1.600 rotações por minuto (rpm) por um
minuto e centrifugar a 50 Xg por um minuto.
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FIGURA 4 – Visualização da placa WG #1 AMP2.
3.5.1.3 Precipitar AMP2
• Centrifugar a placa WG#1 AMP2 a 50 Xg à temperatura ambiente por um minuto.
• Incubar por cinco minutos a 37°C.
• Centrifugar a placa WG#1 AMP2 a 50 Xg à temperatura ambiente por um minuto.
• Remover a capa da placa e adicionar 300 µL de 2-propanol a 100% em cada célula contendo amostras.
• Selar a placa e inverter aproximadamente 10 vezes. • Incubar a placa WG#1 AMP2 por 30 minutos a 4°C.
• Centrifugar a placa WG#1 AMP2 a 3.000 Xg por 20 minutos a 4°C.
• Remover a placa e desprezar o sobrenadante, invertendo rapidamente a placa e depois invertê-la sobre um papel absorvente várias vezes durante um minuto até que as células estejam livres do líquido.
• Inverter a placa sem selar em um suporte por uma hora a 22°C a fim de secar ainda mais o pellet azul.
Amostras de 1 a 8
Placa WG # 1 AMP2 Amostras de 9 a 16 Amostras de 17 a 824
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3.5.1.4 Ressuspender AMP2
• Adicionar 42 µL da solução WG#-RA1 em cada célula da placa WG#1 AMP2 que contiver o pellet de DNA e selar a placa.
• Incubar a placa no Illumina Hyb Oven por uma hora, a 48°C.
• Colocar a placa no vórtex a 1.800 rpm por um minuto e, após, centrifugar em pulso a 280 Xg.
3.5.1.5 Hibridizar no BeadChip
•
Usar papel absorvente (Kimwipe) para lavar cada placa de vidro comálcool 70%.
•
Colocar os selos de metal do IlluminaHyb chamber na câmara BeadChip Hyb .•
Dispensar 200 µL da solução WG # -PB2 em cada um dos reservatórios de tampão (oito no total) da Hyb.•
Selar a câmara Illumina Hyb e deixar em temperatura ambiente.• Colocar o rack com os chips enfileirados e deixá-los submersos em 200 mL de etanol a 100%, agitando-os inicialmente e nos intervalos de cinco e 10 minutos.
• Retirar o rack com os chips submersos em etanol e submergê-los na solução WG# -PB1, agitando-os inicialmente e nos intervalos de dois minutos e meio e cinco minutos.
• Colocar a placa WG #1 AMP2 com as amostras ressuspendidas em bloco aquecido a 95° por 20 minutos
• Secar o rack com os chips, colocando-os na centrífuga a 280 Xg por um minuto.
• Alinhar as placas de vidro com o chip entre elas, colocando o espaçador de plástico, e selá-las com o selo de metal dentro da câmara Illumina Hyb e
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• Remover a WG #1 AMP2 do bloco aquecido e centrifugar em pulso a 280 Xg.
• Recolocar as quatro colunas da placa WG #1 AMP2 na coluna original. • Dispensar 150 µL de formamida a 100% em cada câmera em seu
reservatório final.
• Dispensar 150 µL da solução WG#-RA1 em cada câmera em seu reservatório final.
• Dispensar 150 µL de amostra de DNA a 100% em cada câmera.
3.5.1.6 Incubar o BeadChip
Incubar a Hyb Chamber no Illumina Hyb Oven por 16 horas a 48°C, com o
agitador na velocidade cinco.
3.5.1.7 Estender BC2
A) Para extensão de base única
• Em cada câmera dispensar 150 µL da solução WG #-RA1 em cada reservatório da câmara e incubar por 30 segundos. Repetir seis vezes para cada câmera.
• 450 µL da solução WG # -XC1 e incubar por 10 minutos. • 450 µL da solução WG # -XC2 e incubar por 10 minutos. • 200 µL da solução WG # -TEM e incubar por 15 minutos.
• 450 µL de formamida 95%/1 mM EDTA e incubar por um minuto. Repetir por mais uma vez e esperar por cinco minutos.
• 450 µL da solução WG # -XC3 e incubar por um minuto. Repetir uma vez. • Aguardar até a câmara atingir 37° C.
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B) Stain BeadChip
• Em cada câmera, dispensar- 250 µL da solução WG #LTM e incubar por 10 minutos.
• 450 µL da solução WG # -XC3 e incubar por um minuto. Repetir uma vez e esperar por cinco minutos.
• 250 µL da solução WG#-ATM e incubar por 10 minutos.
• 450 µL da solução WG # -XC3 e incubar por um minuto. Repetir uma vez e esperar por cinco minutos.
• 250 µL da solução WG#-LTM e incubar por 10 minutos.
• 450 µL da solução WG # -XC3 e incubar por um minuto. Repetir uma vez e esperar por cinco minutos.
• 250 µL da solução WG#-ATM e incubar por 10 minutos.
• 450 µL da solução WG # -XC3 e incubar por um minuto. Repetir uma vez e esperar por cinco minutos
• 250 µL da solução WG#-LTM e incubar por 10 minutos.
• 450 µL da solução WG # -XC3 e incubar por um minuto. Repetir uma vez e esperar por cinco minutos.
• Remover as câmeras do chamber rack e colocá-las horizontalmente em temperatura ambiente.
3.5.1.8 Lavar e secar
• Colocar 310 mL da solução WG # -PB1 na câmara de lavar BeadChips. • Mover o rack com os BeadChips para baixo e para cima durante cinco
minutos.
• Colocar 310 mL de WG # -XC4 na câmara de lavar não mais que 10 minutos.
• Retirar o rack com os BeadChips e colocá-los no vácuo até secarem (40-45 minutos a 508 mmHg).
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3.5.1.9 Lendo os BeadChips
• Colocar o primeiro BeadChip no BeadArray Reader Tray.
• Usar o escaneador com código de barras e ler o primeiro BeadChip e pressionar a tecla SCAN.
FIGURA 5 – Sumário do processo do Illumina (www.illumina.com).