Section F – Potential impact of an EU animal welfare label
Section 2. Questions for specific AW labelling systems (only Tierschutzlabel)
A.10 Evolution of on-farm animal welfare practices for the studied species
Todas as tiossemicabazonas foram testadas contra o crescimento de bactérias Staphylococus
aureus e Pseudomonas aeruginosa e de fungos Candida albicans. No entanto, nenhuma delas exibiu
atividade antimicrobiana significativa.
3.3.2 Atividade citotóxica
As tiossemicarbazonas HAc3oT (1), HAc3mT (2), HAc3mCl (4), HAc3mF (5) e HAc3mNO2
(6) foram avaliadas quanto à capacidade de inibir a proliferação de células leucêmicas K562. A 1 µM os compostos não inibiram a proliferação das células. As tiossemicarbazonas acetofenona- e benzofenona- N(3)-orto-toluil, N(3)-meta-toluil e N(3)-para-toluil (HAc3oT (1), HAc3mT (2), HAc3pT (3), HBz3pT (4), HBz3oT (8) e HBz3mT (9)) também foram avaliadas quanto às suas capacidades de inibir o crescimento de células leucêmicas HL-60 e Jurkat a 10 µM, porém demonstraram-se inativas. Os compostos foram também avaliados quanto à citotoxicidade frente a linhagens de células de glioblastoma humano U-87 e T-98. Na tabela 3.3.1 estão as porcentagens de morte celular de U-87 e T-98 na presença das tiossemicarbazonas a 1µM.
Tabela 3.3.1 - Porcentagem de morte celular de glioblastoma humanos U-87 e T-98 na presença das tiossemicarbazonas a 1 µM (%) Composto U-87 T-98 HAc3oT (1) 23,1 ± 14,3 13,6 ± 10,7 HAc3mT (2) 10,0 ± 12,8 1,5 ± 1,9 HAc3pT (3) 19,6 ± 9,0 20,9± 5,3 HAc3mCl (5) 23,6 ± 12,8 16,1 ± 8,6 HAc3mF (6) 31,9 ± 5,6 33,2 ± 2,3 HAc3mNO2 (7) 18,6 ± 9,5 13,8 ± 5,8 HBz3oT(8) 28,2 ± 3,4 13,7 ± 4,0 HBz3mT (9) 16,5 ± 7,3 17,9 ± 8,5 HBz3pT (4) 17,0 ±10,2 23,6 ± 10,3 HBz3mCl (10) 18,5 ± 8,7 18,2 ± 7,3 HBz3mF (11) 17,0 ± 5,8 19,5 ± 4,5 HBzm3NO2 (12) 22,3 ± 9,0 18,3 ± 11,1
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Não ocorreram diferenças significativas nas atividades citotóxicas exercidas pelas diferentes tiossemicarbazonas sobre a linhagem celular U87. A porcentagem de morte celular variou entre 31,9 – 10,0 %, sendo HAc3mF (6) a mais ativa e HAc3mT (2) a menos ativa. Resultados semelhantes foram obtidos contra células T98 em que a porcentagem de morte celular variou entre 33,2 - 1,5 %, sendo HAc3mF (6) a tiossemicarbazona mais ativa e HAc3mT (2) a menos ativa.
Comparações entre essas tiosemicarbazonas e seus análogos derivados de piridina mostram que as últimas são melhores agentes citotóxicos, sugerindo que uma maior capacidade quelante (N-N- S ao invés de N-S) poderia acarretar maior citotoxidez. De fato, se considerarmos que o mecanismo de ação antitumoral das tiossemicarbazonas envolve a inibição da enzima ribonucleosídeo difosfato redutase, seja pela tiossemicarbazona livre que se coordena a um íon ferro(III) da estrutura da enzima, seja através de um complexo de ferro(II) que se oxida liberando um elétron que inativaria o radical livre presente na sub-unidade R2, uma menor capacidade quelante levaria a um menor efeito citotóxico. No entanto, a literatura relata vários exemplos de tiossemicarbazonas potencialmente bidentadas que apresentam ação antitumoral, e cujos mecanismos de ação são distintos do aqui mencionado.9
3.3.3 Toxicidade aguda
As tiossemicarbazonas em geral são ótimos agentes quelantes10. Essa característica é muito
interessante e tem sido investigada para o desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento de pacientes com Mal de Alzheimer. A doença de Alzheimer é muito complexa, e atualmente os tratamentos limitam-se aos sintomas. Uma das principais causas da doença pareceria ser o acúmulo de íons metálicos no cérebro, principalmente cobre(II) e zinco(II).11
HAc3mT (3) além de não mostrar atividade antimicrobiana, demonstrou o menor índice de atividade citotóxica. Esse comportamento, associado à sua capacidade quelante devida ao sistema N-S, faz com que o composto possa constituir um interessante protótipo de fármaco para a terapia do mal de Alzheimer. Assim em uma segunda etapa passamos a investigar seus efeitos tóxicos por meio de um estudo de toxicidade aguda in vivo.
HAc3mT foi denominado BAMT (benzoilacetofenona N(3)-meta toluil tiossemicarbazona) no teste de toxicidade in vivo. Na dose de 300 mg kg-1 o composto não ocasionou nenhum sinal de
toxicidade às ratas Wistar durante o estudo de toxicidade aguda pelo método de classes. Por esse motivo, repetiu-se o experimento aumentando-se a dose para 2000 mg kg-1 de acordo com o
fluxograma (ver capítulo 2, seção 2.5.4).
Um aumento da atividade geral foi observado na primeira hora para o grupo que recebeu o composto, porém o efeito foi reversível no período de observação subseqüente (1 hora). Demais sinais
9 W. Hernández, J. Paz, A. Vaisberg, E. Spodine, R. Richter, L. Beyer, Bioinorg. Chem. Appl. 2008 (2008) 1. 10 B.M. Patersona, P.S. Donnelly, Chem. Soc. Rev. (2011).
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de toxicidade não foram encontrados nas observações diárias realizadas nos treze dias subsequentes do
screening toxicológico (ver tabelas 3.3.2 e 3.3.3).
Tabela 3.3.2 - Sinais observados no tratamento com a dose de 300 mg kg-1
Grupo (mg kgDose -1) T/M Período de observação dos sinais Sinais de toxicidade observados
Controle
(CMC 0,5%) 0 6/0 5’ - 14º dia Sem sinais de toxicidade
BAMT 300 6/0 5’ - 14º dia Sem sinais de toxicidade
Nota: T/M = número de ratos tratados / número de mortes. Observações após administração = 5, 15, 30, 45 minutos, 1, 2, 3, 4, 8 e 24 h, e diariamente até o 14º dia.
Tabela 3.3.3 - Sinais observados no tratamento com a dose de 2000 mg kg-1
Grupo (mg kgDose -1) T/M Período de observação dos sinais Sinais de toxicidade observados
Controle
(óleo de milho) 0 6/0 5’ - 14º dia Sem sinais de toxicidade BAMT 2000 6/0 1h – 14 º dia 5’ – 1h Sem sinais de toxicidade Atividade geral (7)
Nota: T/M = número de ratos tratados / número de mortes. Observações após administração = 5, 15, 30, 45 minutos, 1, 2, 3, 4, 8 e 24 h, e diariamente até o 14º dia. Escore normal: atividade geral (4).
Quanto à massa corporal dos animais e o consumo de alimentos, nenhuma alteração foi detectada, tanto na primeira como na segunda semana (ver figuras 3.10 e 3.11). O dado tabulado como semana 0 corresponde ao peso dos animais no dia da administração.
Figura 3.10- Massa corporal dos animais durante o experimento com a dose de 300 mg kg-1 (A) e de
2000 mg kg-1 (B) (n=6).
A
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Figura 3.11 - Consumo de ração dos animais,em gramas, durante o experimento com a dose de 300 mg kg-1 (A) e de 2000 mg kg-1 (B) (n=6).
Em relação ao consumo de água, foi possível observar uma redução do consumo de água das ratas que consumiram o composto na dose de 2000 mg kg-1 ao serem comparadas com as
ratas do grupo controle (Figura 3.12).
Figura 3.12 - Consumo de água (em gramas) durante o experimento com a dose de 300 mg kg-1 (A) e
de 2000 mg kg-1 (B) (n=6). *Significativamente diferente do grupo controle pelo teste de F (p<0,05).
Como o composto não provocou óbito, ao fim do período de observação de catorze dias, os animais foram submetidos à eutanásia. Os órgãos de todos os animais do grupo BAMT submetidos à
B
A
A
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eutanásia apresentaram os mesmos aspectos morfológicos macroscópicos daqueles do grupo controle. Não foram detectadas alterações na estrutura, rigidez ou coloração das superfícies dos órgãos avaliados macroscopicamente. Também não foram encontradas diferenças estatísticas nas massas dos órgãos dos animais do grupo BAMT quando comparadas ao grupo controle (Figuras 3.13 e 3.14).
Figura 3.13 - Peso dos órgãos coração, pulmão, estômago e cérebro no tratamento com a dose de 300 mg kg-1 (A) e de 2000 mg kg-1 (B).
Figura 3.14 - Peso dos órgãos fígado, baço, rins e útero no tratamento com a dose de 300 mg kg-1 (A) e
de 2000 mg kg-1 (B).
A
B
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Dessa forma, HAc3mT (BAMT) é classificado como um composto de categoria 5, ou seja, toxicidade letal aguda maior que 2000 mg kg-1, possuindo baixa toxicidade oral em dose única.
Futuros testes de biodisponibilidade oral e de capacidade em atravessar a barreira hemato-encefálica deverão ser realizados de modo a complementar esse teste. O valor calculado de logP = 3,87 ± 0,58 sugere que o composto apresenta lipofilia adequada para chegar ao cérebro (1,5 < logP < 5,0).11