Evaluering av en opplevelse

Em nossa proposta de estudo, trabalhamos bastante em caracterizações estruturais da mem- brana lipídica afetada pela ação do peptídeo antimicrobiano. Deste modo, além do grande in- teresse do efeito antimicrobiano deste trabalho, as propriedades físico-químicas de membranas lipídicas também podem ser exploradas por esses estudos. Sobre uma visão geral de membra- nas lipídicas, agentes externos de qualquer natureza: peptídeos, fármacos, entre outros, que se ligam à membrana, consequentemente afetam suas propriedades estruturais. Mais interessante ainda, a deformação criada por um componente externo ligado/inserido na bicamada lipídica obedece a regras extremamente complexas. Os autores (Yolcu, Haussman, e Deserno, 2014) discutem que agentes externos incorporados a membranas, não somente criam perturbações às propriedades elásticas e de curvatura da membrana, como também, respondem pelo efeito de tê-las criado.

Então, sob um ponto de vista mais fundamental, é interessante buscar compreender como os lipídios passam a se organizar para poder acomodar/expulsar um agente externo. Por exemplo, os autores, Koller e Lohner, descrevem a membrana lipídica como um sistema de molas acopla- das, onde a inserção de um componente externo causa um desequilíbrio da tensão da bicamada, podendo levar ao seu rompimento. Neste modelo, é interessante observar que, dependendo da posição espacial do agente externo na bicamada, ou dependendo de como este modifica as propriedades elásticas e de curvatura da membrana, são desencadeados efeitos diferentes na membrana. Por exemplo, o peptídeo inserido na superfície da bicamada pode promover uma assimetria na pressão lateral dos lipídios da camada externa com relação à camada interna (Koller e Lohner, 2014). Por outro lado, um peptídeo atravessando a membrana pode, por exemplo, levar ao estreitamento ou estiramento da bicamada (Gleason et al., 2012), criando tensões diferentes nas regiões onde ocorrem ou não esse efeito.

1.1

Objetivos

O objetivo deste trabalho é estudar a interação do peptídeo antimicrobiano KHya1 com membranas modelo, que são sistemas miméticos de membranas celulares, formados por lipos- somos de composição lipídica controlada.

Neste trabalho buscamos investigar as modificações estruturais que o peptídeo KHya1 causa em membranas compostas por lipídios neutros (mimetizando a membrana celular de eucariotos)

e aniônicos / mistos (mimetizando a membrana celular de eucariotos), investigando também a posição e ambiente do peptídeo na membrana.

1.2

Sumário dos capítulos seguintes

O estudo da interação de peptídeos antimicrobianos com membranas modelo foi abordado com uma ampla variedade de técnicas experimentais. O capítulo seguinte, resume brevemente a teoria das principais técnicas experimentais utilizadas ao longo da tese.

No capítulo 3, Modelos e Controles, descrevemos o sistema modelo adotado, suas peculia- ridades e as justificativas da escolha por tais modelos. Além disso, mostramos alguns experi- mentos controle importantes para a caracterização correta de nossos resultados experimentais. O estudo da interação do peptídeo KHya1 com membranas modelo foi divido nos capítulos 4, 5 e 6. No capítulo 4 discutimos diferentes efeitos que o peptídeo causa em membranas neutras e em membranas compostas por lipídios negativamente carregados. Essas diferenças foram evidenciadas com o uso de diversas técnicas experimentais: Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC), fluorescência estática do Trp, espalhamento de luz dinâmico, experimentos de vazamento de sonda fluorescente encapsulada pelos lipossomos e microscopia óptica. Neste capítulo discutimos os possíveis modelos que podem levar aos distintos efeitos observados em membranas neutras e aniônicas, como por exemplo o peptídeo se ligando a diferentes posições na membrana dependendo de densidade de carga.

No capítulo 5 realizamos um estudo com a técnica de fluorescência: estática e resolvida no tempo. Esse estudo tem como foco principal a interação do peptídeo antimicrobiano KHya1 com membranas compostas por DPPG, pois foi observado que o peptídeo causa um efeito peculiar em membranas aniônicas, levando a coexistência de dois diferentes regimes em membranas negativamente carregadas. Neste capítulo, monitoramos a fluorescência (estática e temporal) da sonda natural Trp do peptídeo e da sonda exógena, Laurdan, incorporada na bicamada. Além disso, caracterizamos o par Trp-Laurdan como doador-aceitador no processo de transferência de energia (FRET), onde a monitoração da eficiência do FRET também pode sugerir a formação de poros em membranas compostas por lipídios aniônicos. Além disso, a possível interação entre resíduos de Trp (Homo-FRET) sugere uma distribuição não homogênea de peptídeos na membrana.

Por fim, no capítulo 6 estudamos a interação do peptídeo KHya1 com membranas modelo neutras e compostas por lipídios aniônicos com o uso da técnicas experimentais: ressonância pa-

ramagnética eletrônica (ESR) e espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS). Os resultados confirmam que o peptídeo antimicrobiano KHya1 liga-se em diferentes posições em membra- nas neutras e membranas aniônicas. Embora essa hipótese tenha sido discutida ao longo dos capítulos 4 e 5, neste trazemos outras fortes evidencias experimentais de que o peptídeo pode ocupar diferentes posições na membrana dependendo da composição lipídica. Deste modo, as perturbações que o peptídeo causa à membrana estão fortemente correlacionadas a sua posição na bicamada.

O peptídeo KHay1 também foi testado em modelos de membrana com coexistência de fases (liquida ordernada, (Lo)+ liquida desordenada, (Ld)) e resultados preliminares podem ser encontrados no apêndice D.

Capítulo 7

Conclusões

Esse trabalho mostra diferentes interações do peptídeo antimicrobiano KHya1 com membra- nas neutras, e membranas negativamente carregadas. As diferenças na interação do peptídeo com membranas modelo foram mostradas por diversas técnicas experimentais: calorimetria di- ferencial de varredura (DSC), fluorescência estática e temporal, utilizando a sonda natural do peptídeo (Trp) e sonda extrínseca de bicamada (Laurdan), por vazamento de sonda fluorescente encapsulada, espalhamento de luz dinâmico, microscopia óptica, ressonância paramagnética eletrônica (ESR) e espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS). A seguir resumimos as principais diferenças observadas de acordo com a composição lipídica.

DPPC

Observamos que em membranas neutras o peptídeo KHya1 causa uma perturbação média na membrana, diminuindo a cooperatividade dos lipídios ao longo da transição de fase (DSC), de modo a sugerir que o peptídeo pode se difundir na membrana, estando pouco ancorado à superfície da mesma, possivelmente, ocupando uma posição mais próxima à superfície.

A fluorescência estática do Trp em membranas neutras mostrou que a interação do peptídeo com a membrana depende da temperatura, e, portanto, da fase da bicamada, sendo que na fase fluida pode haver mais peptídeos ligados à membrana e/ou os peptídeos podem inserir-se em regiões mais apolares da bicamada.

Experimentos de vazamento de sonda fluorescente encapsulada por lipossomos mostram que o peptídeo também causa vazamento em membranas neutras, mas, a partir de [P]/[L]=0.04, a porcentagem de vazamento final cresce muito lentamente com a concentração de peptídeo. As cinéticas de vazamento também mostraram uma resposta de vazamento mais lenta, comparada

ao observado em vesículas aniônicas. A microscopia óptica também observou perda de contraste de GUVs, e, diferentemente do observado em vesículas aniônicas, não foi visto formação de grandes poros e destruição dos lipossomos. Deste modo, o vazamento em membranas neutras pode ser devido à inserção/ difusão do peptídeo próximo à superfície, causando defeitos na bicamada e aumentando a permeabilidade da membrana.

Os resultados de ESR mostraram que o peptídeo causa o aumento do empacotamento da membrana na região do carbono 5, e causa pequenas perturbações na região do carbono 16, para as fases gel e fluida, corroborando a hipótese do peptídeo localizar-se na superfície da membrana.

Os resultados de SAXS também mostraram que a interação do peptídeo com a membrana neutra depende da temperatura, ou fase de bicamada, em acordo com a fluorescência estática do Trp. Além disso, o peptídeo causa pequeno estreitamento na membrana (fase gel principal- mente), mas esse efeito não cresce com o aumento da concentração de peptídeo. Na fase gel e altas concentrações de peptídeo, foi observado um fator de estrutura que pode estar relacionado à formação de MLVs1

Portanto, reunindo os resultados aqui apresentados, podemos sugerir que o peptídeo pode estar localizado próximo à superfície, conforme ilustra a Figura 7.1.

Figura 7.1: Modelo para interação do peptídeo antimicrobiano com membranas neutras de DPPC.