Evaluation

A infecção toxoplásmica dos ovinos reprodutores utilizados nesta pesquisa, após a inoculação de taquizoítos ou oocistos de T. gondii, confirmou-se pela parasitemia e também pela soroconversão de todos os animais inoculados (Tabelas 12 e 13). Sinais clínicos como hipertermia, apatia, anorexia e fezes amolecidas, foram observadas nos animais que receberam oocistos (cepa P) entre o 5º e 7º DPI (Figuras 4 e 5). Nos animais inoculados com taquizoítos observou-se, de modo geral, um quadro assintomático.

COLE et al. (1954), utilizando-se de uma amostra de T. gondii isolada de um caso natural, inocularam 10 ovelhas e três cordeiros. O período de incubação variou de um a seis dias, e os sinais clínicos mais freqüentes em nove ovelhas e nos três cordeiros foram febre, dispnéia e incoordenação motora. A infecção foi fatal em duas ovelhas e em um cordeiro.

GARNHAN & LAISON (1960) infectaram cordeiros com duas semanas de idade, com aproximadamente 100 cistos de T. gondii (cepa não mencionada), pelas vias intraperitoneal (IP), endovenosa (EV) e oral (VO). Sinais clínicos não foram observados, mas de duas semanas até nove meses pós-inoculação, anticorpos contra-Toxoplasma foram detectados, utilizando-se a reação de Sabin & Feldman, nos ovinos inoculados.

DUBEY (1986) relata que as manifestações clínicas da toxoplasmose experimental em ovinos são influenciadas principalmente pela patogenicidade da cepa e dose do inóculo. Além disso, características individuais dos animais, como resistência do hospedeiro, também parecem influir na manifestação clínica da toxoplasmose. Outro aspecto a ser considerado, são as cepas de T. gondii (P e RH) utilizadas no presente trabalho, uma vez que, nenhuma referência sobre a utilização destas cepas em ovinos foi detectada na literatura, o que dificulta uma discussão mais profunda.

A detecção do T. gondii na corrente sanguínea (parasitemia) dos ovinos experimentais foi verificada de forma indireta, por meio de soroconversão dos camundongos inoculados com camadas leucocitárias. Os surtos parasitêmicos ocorreram em cinco dos seis ovinos inoculados. Dos 10 picos de parasitemia detectados, três foram entre o 7º e 11º DPI, três no 35º e outros três entre o 56º e 63º DPI (Tabela 12). A alta freqüência de surtos parasitêmicos, observadas nesta pesquisa, pode estar relacionada à susceptibilidade do hospedeiro frente às cepas empregadas (P e RH). Resultados semelhantes foram observados por DUBEY & SHARMA (1980), que inocularam ovinos com oocistos via oral (cepa GT-1). Detectaram parasitemia nos sete ovinos no 6º e 11º DPI. TEALE et al (1982) de oito ovinos inoculados, recuperaram

T. gondii (parasitemia) somente em dois, sendo um no 21º e outro no 26º DPI.

A utilização da IFI para o diagnóstico e levantamentos epidemiológicos de infecção toxoplásmica tem tido aceitação universal, tanto para espécie humana como para outras espécies animais, principalmente por ser considerada de fácil execução e boa sensibilidade (ARAÚJO et la., 1998). Além disso, os antígenos de superfície de T.

gondii parecem ser comuns a diferentes cepas do protozoário e apresentam papel

predominante na reação de imunofluorescência indireta (BEKNER DA SILVA et al., 1994). Embora a IFI não seja adequada para distinguir sorologicamente diferentes amostras de T. gondii (a técnica de Western & Blot é mais indicada para esta função), ela foi eleita para avaliação da resposta imune humoral dos ovinos do presente estudo.

A infecção experimental em ovinos com T. gondii desencadeou um resposta imunológica rápida, com detecção de anticorpos a partir do 5º DPI, conforme pode ser observado na Tabela 13. Esta precocidade na resposta humoral em infecções experimentais de T. gondii, foi também detectada por SCARPELLI (2001) em bovinos, MOURA (2004) em suínos e por ARANTES (2005) em cães. BERVERLEY & WASTON (1971), estudando um rebanho de 22 ovelhas com histórico de aborto natural há mais de um ano, observaram títulos de anticorpos (detectados por meio do teste de Sabin & Feldman) de 1:1024 (cinco fêmeas), 1:256 (nove fêmeas), 1:64 (seis fêmeas) e 1:16 (duas fêmeas).

A curva de IgG observada neste experimento (Tabela 13 e 14) teve seu início a partir do 5º DPI (ovinos 02 e 16 inoculados com oocistos e o reprodutor 52 inoculado com taquizoítos) todos apresentando títulos de 1:16. Picos de 1:4096 foram atingidos pelos seis animais inoculados no 28º DPI. O ovino 52, infectado com taquizoítos, atingiu título de 1:8192 nesta mesma data pós-inoculação. Convém salientar que a resposta imune humoral (para os seis animais inoculados) permaneceu em patamares elevados, do 21º ao 56º DPI, decrescendo posteriormente. Estes achados harmonizam-se com os relatados por SHARMA & SHIMIZU (1974), citados por DUBEY (1986). Estes autores relatam que anticorpos relacionados à infecção crônica (IgG) apresentam a capacidade de manterem “ativos” por longo período (até 70º DPI no presente trabalho), quando comparados com as imunoglobulinas da classe IgM, notadamente identificadas apenas nas primeiras semanas após infecção.

A avaliação espermática é largamente utilizada no manejo reprodutivo de diversas espécies animais, sendo considerada de extrema importância para o monitoramento de ovinos reprodutores. Frequentemente realiza-se tal avaliação, como exame de rotina em animais selecionados para acasalamento, ou como meio de diagnóstico de alterações da esfera reprodutiva (VANNUCHI et al., 1998).

Diminuição no volume do ejaculado e no vigor dos espermatozóides pode ser constatada em algumas datas pós-inoculação, nos animais dos grupos I e II (oocistos e taquizoítos respectivamente) (Tabelas 8, 9 e 11). Semelhantemente, TEALE et al. (1982) também avaliaram a qualidade espermática (concentração por meio da análise visual da densidade e motilidade) para estudar possíveis influências do T. gondii nas funções reprodutivas. É importante ressaltar que, embora alterações e variações tenham sido observadas, no presente ensaio, estas foram aleatórias, não podendo ser impingidas ao T. gondii. Outro fator que também pode ter contribuído para diminuição do volume e da motilidade, pode ter sido as elevadas temperaturas constatadas ao longo do experimento, à semelhança do ocorrido em outros estudos (KUNAVONGKRIT & PRATEEP 1995; KUO et al., 1997 e MOURA, 2004).

PRIETO et al. (1996) e OWSIANNY et al. (1998) afirmam, ainda, que os parâmetros seminais e a morfologia espermática podem ser influenciados por diversos

fatores, tais como: causas infecciosas (ex.: vírus da síndrome respiratória), condições climáticas e até mesmo por características fenotípicas como tamanho/volume testicular.

Alterações anatomopatológicas decorrentes da infecção toxoplásmica induzida, não foram observadas no presente estudo. Achados necroscópicos, inclusive histológicos, descritos em diversos experimentos comprovam a existência de controvérsias no que concerne aos resultados poderem ou não ser atribuídos ao T.

gondii

A primeira notificação de isolamento de T. gondii em amostras seminais de ovinos, encontrada na literatura, pertence a SPENCE et al. (1978). DISKO et al. (1971) tiveram sucesso na tentativa de recuperação deste agente em amostras seminais de três de 125 homens com infecção toxoplásmica natural. SPENCE et al (1978), TEALE et al. (1982) e AGANGA et al. (1988) pesquisando amostras seminais de ovinos, DUBEY & SHARMA (1980) em caprinos, SCARPELLI (2001) em bovinos, MOURA (2004) em suínos e ARANTES (2005) em caninos, obtiveram resultados positivos, pela bioprova detectando T. gondii nos ejaculados colhidos de animais experimentalmente infectados.

Os resultados do presente trabalho constituem a primeira descrição do isolamento de T. gondii de amostras seminais de ovinos experimentalmente infectados, utilizando-se de duas técnicas (bioprova e PCR) (Tabela 15 e Figura 13 respectivamente). Os autores supramencionados isolaram T. gondii apenas pela bioprova. A despeito das diferentes cepas, inóculos e vias de infecção, os resultados referentes à recuperação do protozoário de amostras seminais (neste trabalho) parecem discordar com alguns autores, principalmente em relação ao período em que se logrou êxito. SPENCE et al. (1978) inocularam T. gondii (cepa não descrita) em dois ovinos e detectaram sêmen infectado no 20º DPI de um dos animais e no 25º DPI do segundo ovino. Em um segundo experimento, T. gondii foi isolado de um dos ovinos de forma constante, do 7º ao 32º DPI. Do outro animal, estes autores conseguiram recuperar o agente somente em duas ocasiões (14º e 32º DPI).

Ainda em ovinos, TEALE et al. (1982) inocularam seis animais com 2000 cistos cada (cepa não mencionada), pela via subcutânea. A presença de T. gondii nas

amostras seminais dos carneiros foi observada em três dos seis animais inoculados, em duas ocasiões para cada um dos ovinos (16º e 26º DPI). Também em ovinos, AGANGA et al. (1988), na Nigéria, num trabalho envolvendo inoculação de reprodutores ovinos (cepa TS-1), puderam recuperar T. gondii em amostras seminais colhidas no 21º DPI de todos os machos infectados.

Em caprinos, DUBEY & SHARMA (1980) inocularam, por via oral, 104 oocistos

da cepa GT-1 (isolada de caprinos), e conseguiram detectar T. gondii no sêmen por meio do bioensaio (bioprova), durante um período mais prolongado (do 7º ao 59º DPI). Os autores basearam-se na sorologia positiva e na presença de cistos cerebrais dos camundongos inoculados com amostras seminais dos animais experimentalmente infectados com T. gondii.

SCARPELLI (2001) na espécie bovina, detectou em amostras seminais o T.

gondii (cepas P e RH), por meio da bioprova, em diversas datas pós-inoculação (do 7º

ao 84º DPI). Entretanto, a técnica de PCR não foi tão sensível/específica na detecção do parasito no sêmen de bovinos experimentalmente infectados. Semelhantemente MOURA (2004), em suínos, obteve pouco sucesso no emprego da PCR para detecção de T. gondii no sêmen de cachaços infectados experimentalmente. Por outro lado, este autor isolou T. gondii em amostras seminais de reprodutores experimentalmente infectados (cepas P e RH respectivamente), no 3º, 49º e 56º DPI de um suíno inoculado com oocistos, no 5º e 49º DPI de outro cachaço inoculado com taquizoítos e no 49º DPI de um terceiro suíno infectado também com taquizoítos. Pesquisando o DNA toxoplásmico por meio da PCR, detectou o coccídio no 84º DPI em amostras de dois suínos (um inoculado com oocistos e outro com taquizoítos de T. gondii).

Em cães, ARANTES (2005) isolou T. gondii (bioprova) em ejaculados de dois dos três inoculados com taquizoítos (no 7º e 21º DPI, nas amostras seminais do cão 01 e no 35º DPI nos ejaculados do cão 24). Nos animais inoculados com oocistos, a presença do parasito foi detectada em amostras seminais apenas do cão 31 no 7º DPI. Utilizando a técnica da PCR, detectou o DNA de T. gondii no sêmen do cão 01 (inoculado com taquizoítos) no 7º, 21º e 35º DPI (detectados também pela bioprova). Nas amostras seminais do cão 24 (inoculado com taquizoítos), o DNA do parasito foi

detectado no 35º DPI, confirmando os achados da bioprova das mesmas amostras. A amostra seminal do cão 31 (inoculado com oocistos) não se mostrou positiva para T.

gondii por meio da PCR.

No presente trabalho, pela bioprova (Tabela 15) isolou-se T. gondii em ejaculados dos três ovinos inoculados com taquizoítos (no 5º e 70º DPI nas amostras do ovino 07, no 14º DPI do reprodutor 48 e no 11º, 21º, 49º e 56º DPI do ovino 52). Nos ovinos que receberam oocistos, a presença do parasito também foi detectada em amostras seminais dos três ovinos inoculados (no 14º, 42º e 63º DPI do ovino 02, 35º, no 56º e 63º DPI do número 09 e no 49º DPI do ovino 16). Utilizando a técnica da PCR, para amostras seminais positivas na bioprova, detectou-se o DNA de T. gondii (Figura 13) no sêmen dos ovinos inoculados com taquizoítos no 70º DPI (ovino 07), no 14º DPI (ovino 48) e no 11º, 21º e 56º DPI (ovino 52). Nas amostras seminais dos reprodutores inoculados com oocistos, o DNA do parasito pode ser detectado no ovino 02 (14º, 42º e 63º DPI) e no macho 09 (35º e 56º DPI). Amostras seminais (positivas na bioprova) dos ovinos 07 (5º DPI), 52 (49º DPI), 09 (63º DPI) e 16 (49º DPI) não se mostraram positivas para T. gondii por meio da PCR (Figura 13).

Salienta-se que, além de todos reprodutores (inoculados) produzirem anticorpos contra-Toxoplasma, e amostras seminais mostraram-se positivas para T. gondii (bioprova e PCR), foi possível, ainda, isolar este coccídio por meio da bioprova e da técnica de PCR (Figura 16), no “pool” de tecidos (testículos, epidídimos, vesícula seminal e próstata) de dois ovinos infectados experimentalmente com oocistos (ovino 02 e 16) e um inoculado com taquizoítos (ovino 07).

A ausência de positividade de parasitismo, detectada pela PCR, de algumas amostras genômicas seminais e do “pool” tecidual dos ovinos infectados experimentalmente, a possibilidade de T. gondii estar presente nas mesmas não pode ser descartada, uma vez que parte destes possa ter sido perdido com a técnica de extração de DNA, além de que, 500ng de DNA “genômico” (hospedeiro+parasito) por reação, pode conter uma baixa quantidade de DNA do parasito, que pode ser insuficiente para visualizar a amplificação de 194 bps no gel de eletroforese 2% corado com brometo de etídeo (DUBEY & THULLIEZ, 1993; ESTEBANREDONDO et al 1999 e

AQUIZERATE et al 1993). Alguns autores afirmam que a técnica da PCR pode ser um método vantajoso, quando associado a outro meio de diagnóstico (STEUBER et al 1995 e ELLIS 1998).

Deste modo, os achados da PCR apenas reforçam os achados da bioprova e evidenciam que esta técnica pode ser uma ferramenta auxiliar no diagnóstico da

infecção toxoplásmica. Neste trabalho, um segmento de 194 bps do gene B1 de T.

gondii foi amplificado, uma vez que este gene está presente em pelo menos 35 lócus do

genoma de T. gondii e por ser amplamente conservado nos várias cepas analisadas (BURG et al., 1989 e FUENTES et al., 1996).

Recentemente, um fragmento do DNA de T. gondii de 529 bps, que se repete entre 200 a 300 vezes no genoma do parasito, foi mapeado, o que possivelmente amplia a sensibilidade do teste. Este fragmento apresentou sensibilidade variando de idêntica a dez vezes superior, dependendo do tipo de material utilizado, quando

comparado com os resultados da PCR empregando-se o gene B1 (HOMAN et al. 2000).

O gene B1, porém tem seu uso mais difundido na pesquisa do T. gondii, a partir de

diversos tecidos e fluídos.

GARNHAM & LAIHSOM (1960) notificaram o primeiro relato de T. gondii em tecidos de ovinos. Tais ovinos foram inoculados com cistos e eutanasiádos no 112º DPI (três animais) e no 150º DPI (um ovino). T. gondii foi isolado no cérebro, musculatura esquelética, coração e fígado pelo bioensaio em camundongos.

JACOBS et al. (1963) isolaram T. gondii de 67% dos ovinos sorologicamente positivos, sendo que o diafragma foi o tecido mais parasitado, seguido pela musculatura esquelética e cérebro. WORK (1967) na Dinamarca realizou tentativas de isolamento de

T. gondii em diafragma de 30 ovinos, dos quais sete se mostraram positivos. HARTLEY

& MOYLE (1974) isolaram T. gondii em 14 de 15 cordeiros com infecção congênita. Neste caso, cérebro e musculatura esquelética apresentaram-se positivos para este parasito. Em oito ovinos inoculados com 10.000 oocistos da cepa GT-1, eutanasiádos no 97 º e 173º DPI, DUBEY (1984) verificou a presença de T. gondii no coração de sete destes animais, diafragma, fígado e musculatura esquelética em seis ovinos e quatro animais apresentaram o cérebro parasitado por este protozoário.