A eliminação do LPS de preparações biológicas permanece como um problema importante, que vem ocupando muitos pesquisadores e sendo tema de inúmeras pesquisas. Estas moléculas são altamente estáveis e não são destruídas em processos de esterilização (121 ºC por 30 minutos, calor úmido), sendo necessária uma temperatura de 250 ºC por mais de 30 minutos ou 180 ºC por mais de 3 horas para inativar a molécula de LPS. Além disso, sua remoção torna-se mais difícil quando associado a moléculas lábeis, tais como proteínas (Magalhães et al., 2007; Saraswat et al., 2013).
Estudos mostram que mesmo no final de processos de purificação com múltiplas etapas, a solução protéica permanece com níveis elevados de endotoxina. Em seu trabalho, Dudley et al. (2003), acompanharam o progresso de remoção de endotoxinas durante a purificação de domínios do plasminogênio expressos em E.
coli. Embora tenham obtido elevado grau de pureza para as proteínas de interesse,
após uma sequência com cromatografia de afinidade seguida de cromatografia de troca catiônica, o produto final apresentou um conteúdo de elevado de endotoxina.
Diversos métodos vêm sendo testados na tentativa de diminuir a contaminação por LPS em preparações farmacêuticas, incluindo ultrafiltração, adsorção por afinidade, cromatografia de troca iônica, cromatografia de filtração em gel, centrifugação por gradiente de sacarose e separação de fases por triton X-114 (Magalhães et al., 2007, Lopes et al., 2010; Ongkudon et al., 2012). Porém, os métodos desenvolvidos para remoção de endotoxina devem ser avaliados caso a
caso, pois sua aplicabilidade depende das características da proteína alvo, o que torna difícil encontrar um único método aplicável em todos os casos (Saraswat et al., 2013).
A ultrafiltração é uma técnica empregada na remoção de LPS em soluções isentas de proteínas, pois é baseada na diferença de tamanho de entre as moléculas de endotoxina e de água e outras moléculas pequenas, sendo empregada rotineiramente na obtenção de água ultrapura nas unidades de hemodiálise (Petsch, & Anspach, 2000, Aspash, 2001). A adsorção por afinidade tem sido empregada com sucesso na remoção de LPS de preparações de proteínas recombinantes. O método consiste na aplicação da solução protéica em colunas contendo ligantes capazes de capturar o LPS, como polimixina B, L-histidina, poli-L-lisina e poli-ɣ-metil- L-glutamato (Aspash, 2001).
Uma das técnicas cromatográficas mais utilizadas atualmente para remoção endotoxina é a cromatografia de troca iônica. Esta técnica baseia-se no fato das endotoxinas serem carregadas negativamente devido aos grupos fosfato presentes no lipídeo A. Como consequência, trocadores aniônicos como DEAE-sepharose podem ser empregados para a sua adsorção a partir de soluções protéicas (Hirayama & Sakata, 2002). No entanto, apenas proteínas com carga positiva, devem ser tratadas com troca aniônica. Quando proteínas negativamente carregadas necessitam ser purificadas, elas co-adsorvem na matriz, o que causa perda significativa da proteína de interesse. As proteínas positivamente carregadas podem formar complexos com os LPS, o que pode causar um arraste das proteínas pelo LPS ao longo da coluna, minimizando a eficiência do processo de purificação (Aspash, 2001).
Na cromatografia de interação hidrofóbica, as cadeias de ácidos graxos do lipídeo A se ligam ao adsorvente, porém esta técnica geralmente é pouco efetiva e
seu desempenho depende da presença de íons cosmotrópicos e modificadores orgânicos (Petsch & Anspach, 2001). A adição de (2,5-Dioxo-4-imidazolidinil) ureia, também conhecido como alantoína, às soluções protéicas tem mostrado resultados interessantes, com remoção de LPS de até 99,98% (Vagenend et al., 2013a). Em soluções supersaturadas, os cristais de alantoína não dissolvidos são capazes de adsorver o LPS através da formação de pontes de hidrogênio com os grupamentos amida na superfície dos cristais (Vagenend et al., 2013b).
Uma técnica utilizada para a remoção do LPS que vêm mostrando resultados promissores é o sistema micelar de duas fases aquosas (SMDFA). Nesta técnica, um tensoativo em solução aquosa, sob determinadas condições, separa-se espontaneamente em duas fases imiscíveis, uma fase rica e outra pobre em micelas, e as proteínas e outras biomoléculas tendem a se distribuir de forma desigual entre estas duas fases (Asenjo & Andrews, 2012). Lopes et al. (2011) observaram que o SMDA utilizando o tensoativo não iônico triton-X 114 foi eficiente na remoção do LPS para a fase rica em micelas (>98,0%) e seletivo em purificar a proteína verde fluorescente produzida em E. coli, que particionou preferencialmente para fase pobre em micelas. No entanto, o SMDFA apresenta limitações quando se deseja obter proteínas com elevado grau de pureza, devendo ser associada a outras técnicas, além de apresentar problemas quanto à implementação do processo de forma contínua (Saraswat et al., 2013; Espitia-Saloma et al., 2014).
Outra alternativa para remoção do LPS é a inclusão do Triton-X 114 durante a etapa de lavagem dos processos cromatográficos. Reichelt et al. (2006) e Zimmerman et al. (2006) avaliaram a remoção do LPS através de cromatografia de afinidade com uma etapa de lavagem utilizando triton X-114. A aplicação de 0,1% do tensoativo na etapa de lavagem foi bem sucedida na redução de LPS durante a purificação de sete proteínas.
Em preparações altamente contaminadas, mesmo após uma remoção de 98 a 99% do LPS, a concentração residual deste contaminante ainda pode ser elevada. Uma proteína recombinante proveniente do rompimento celular de E. coli com uma concentração inicial de LPS de 9.36 x 107 UE/mL, após a remoção de 99%, a quantidade de LPS residual presente ainda será de 102 UE/mL, uma concentração inaceitável se o principal objetivo é produzir um produto para uso parenteral (Lopes
et al., 2011). Portanto, uma etapa adicional para remoção de LPS pode ser
necessária, uma vez que o limite preconizado pelas agências regulatórias para liberação de produtos farmacêuticos e biológicos é de até 5,0 UE/kg (United States Pharmacopoeia, 1999; Petsh e Aspach, 2000; Farmacopeia Brasileira, 2010). No entanto, uma concentração extremamente baixa de endotoxina não é necessária em todos os casos. Uma vez que muitas proteínas são administradas em doses extremamente baixas, preparações protéicas contendo níveis moderados de endotoxina podem cumprir as exigências regulatórias. De acordo com a Farmacopeia Europeia (European Pharmacopoeia, 1997), 10 UE/mg são permitidos para insulina, e até mesmo 100 UE/mg para o interferon-α (Petsh e Aspach, 2000).
3.4 Modelagem matemática
A combinação da modelagem matemática com experimentos fornece um conjunto de elementos que garante o desenvolvimento racional de um processo, reduzindo substancialmente os gastos de operação, uma vez que os parâmetros do modelo podem ser estimados a partir de um número limitado de experimentos. A simulação com o modelo complementa esse desenvolvimento e pode auxiliar no planejamento do processo, identificando os parâmetros e fontes de variabilidade críticos (Mollerup et al., 2008; Santana et al., 2013).
Nos últimos anos, a modelagem e simulação de processos de adsorção de proteínas em resinas cromatográficas, utilizando colunas de leito fixo ou expandido, vêm sendo empregada por diversos autores (El-Sayed & Chase, 2010; Burkert et al., 2011; Gu et al., 2013; Santana et al., 2013; Moraes et al., 2013). Uma parte destes estudos utilizam sistemas-modelo de proteínas, que consistem em observar a adsorção de uma proteína comercial pura sobre a resina. No entanto, industrialmente, a simulação de um processo só é vantajosa se representar a condição real do processo, que dificilmente empregará a adsorção de uma proteína purificada num leito de resina (Moraes, 2009). Nos últimos anos têm-se observado um aumento no número de estudos utilizando sistemas reais, em que o composto de interesse é adsorvido de um caldo proveniente de fermentação, ou alguma proteína extraída do interior de células microbianas juntamente com outros compostos interferentes (Moraes et al., 2009; Santana et al., 2013; Padilha, 2013).
Em colunas cromatográficas, a adsorção do soluto no adsorvente pode ser descrita pelas curvas de ruptura, que, ao contrário da determinação dos modelos em reator de mistura, avalia o processo adsortivo em uma condição semelhante à condição real de operação do processo (Moraes, 2009). Durante o processo de purificação, a etapa de adsorção deve ser interrompida antes da saturação do adsorvente, de modo a evitar perdas do adsorbato no efluente. Em escala industrial, os valores da concentração de ruptura e da concentração de exaustão, sugeridos como sendo 10% e 90% da concentração de entrada, respectivamente, devem ser determinados após uma avaliação econômica, pois tanto a quantidade de soluto adsorvido como o tempo de operação tem impacto importante sobre os rendimentos da coluna e do processo (Jungbauer, 2005; Bautista et al., 2003).
O processo cromatográfico envolve também uma intricada combinação de fenômenos complexos de origens hidrodinâmica, termodinâmica e cinética, que
frequentemente interagem entre si, e tornam sua análise complicada (Saraiva, 2003). Portanto, a modelagem da curva de ruptura é fundamental para um melhor entendimento do perfil de adsorção e para usar essa informação como uma ferramenta no planejamento e otimização de parâmetros operacionais (Yun et al., 2005).
As curvas de ruptura podem ser matematicamente modeladas, através de equações que descrevem o comportamento hidrodinâmico e perfil de adsorção no leito expandido (Moraes et al., 2013). Existem diversos modelos utilizados na modelagem matemática os sistemas cromatográficos, incluindo o modelo de equilíbrio local, o modelo de placa, o modelo estocástico-dispersivo, o modelo de parâmetros agrupados e o modelo de taxa geral (Gu et al., 2013).
O modelo de taxa geral é baseado em um sistema de equações controladas pelos fenômenos de transferência de massa e termodinâmica. Esta abordagem considera todas as possíveis contribuições à cinética de transferência de massa, que são a dispersão axial, a resistência à transferência de massa no filme líquido, a difusão dentro dos poros e a taxa de adsorção-dessorção (Guiochon et al., 2006). Estes mecanismos são incorporados ao um modelo matemático, que é válido por sua habilidade em predizer as curvas de ruptura.
Segundo Skidmore et al. (1990), as seguintes considerações são necessárias para formulação deste modelo:
O adsorvente é constituído de um material poroso, no qual o adsorbato pode difundir-se livremente. A difusão intraparticular é descrita pela difusibilidade efetiva no poro (Def). Este parâmetro é depende da porosidade do adsorvente
e da dimensão das partículas, mas é independente da concentração do adsorbato.
A transferência de massa na superfície do adsorvente é governada pelo coeficiente de transferência no filme líquido (Kf).
A interação adsorbato-adsorvente pode ser representada por uma reação de segunda ordem reversível, e o equilíbrio pode ser representado pela isoterma de Langmuir.
As partículas do adsorvente são esféricas de tamanho e densidade uniformes, e os grupos funcionais estão uniformemente distribuídos no interior da partícula.
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