O objetivo final no tratamento da AAR é alcançar o melhor resultado possível, em termos de continência fecal. Para tanto, o tratamento cirúrgico visa à criação de um orifício anal adequado para a passagem regular de fezes, anatomicamente bem posicionado em relação ao complexo esfincteriano (15) e
com preservação do esfíncter interno (22). No entanto, essa reconstrução
anatômica das estruturas esfincterianas voluntárias e involuntárias não significa que a função intestinal será normal (15). Sabe-se hoje que o resultado final do
tratamento depende, entre outras coisas, do tipo de anomalia, do grau de desenvolvimento da musculatura perineal e da presença ou não de malformações associadas (4). Além disso, não existe um critério universal de
avaliação da função intestinal, inviabilizando a comparação dos resultados de diferentes séries (6). Peña em 1995 (4), analisando pacientes portadores de AAR
alta submetidos à anorretoplastia sagital posterior, relata 36% de continência. Rintala em 2002 (6), analisando um grupo de pacientes adultos portadores de AAR baixa, encontrou hábito intestinal normal em somente 15%.
Independente do critério de avaliação utilizado, uma queixa freqüente no pós-operatório é a constipação intestinal, acometendo de 30 a 60% dos pacientes (6). A constipação deve ser tratada de forma agressiva, pois pode desencadear um quadro de pseudo-incontinência (1,6,7,9-11). O acúmulo de fezes forma um fecaloma que impede o paciente de sentir e controlar suas evacuações, ocorrendo, então, escapes fecais (10,11).
Na grande maioria dos casos, o tratamento da constipação apresenta bons resultados com o emprego de dieta, laxativos orais e clister. Entretanto, alguns pacientes exibem quadros graves de constipação que não respondem às medidas terapêuticas habituais, além de apresentar o reto e o sigmóide extremamente dilatados, atônicos, ectásicos e com deficiente função propulsiva
(1,6,9-13). Stephens et al (1) rotularam essa condição de “rectal inertia” e
preconizavam a retossigmoidectomia. Nixon et al (9) em uma análise de 78
pacientes portadores de AAR encontraram inércia retal em 11 de 31 portadores de anomalias baixas e em quatro de 47 portadores de anomalias altas. Brent et
al (12) se referiam a essa situação como “primary rectal ectasia”. Powell (10)
descreveu nove pacientes com essa característica rotulando-os de “megarectum” e tratando-os com retossigmoidectomia e abaixamento endoanal. Cheu (13) descreveu três pacientes com reto extremamente dilatado,
com mobilidade ineficaz e propulsão mínima, rotulando-o de “atonic baggy rectum” e nos quais realizou a retossigmoidectomia com preservação de coto retal de quatro centímetros. Peña et al (11) relataram três pacientes com constipação intratável associada com megarreto e megassigmóide nos quais realizaram somente a sigmoidectomia com bons resultados de continência fecal. Segundo Peña et al (11), o reto deve ser preservado, pois possui função de reservatório fecal e a sua ressecção implicaria em incontinência fecal.
A constipação intestinal nos pacientes portadores de AAR pode resultar de estenose do orifício anal (1,9), anormalidades da inervação entérica extrínseca (1,14,15), denervação do reto por ocasião do procedimento cirúrgico (6,11,14,16,17), alterações regionais da inervação entérica intrínseca (18-26) e alterações das células intersticiais de Cajal (30).
A estenose do orifício anal deve ser pesquisada sempre e, quando da sua ocorrência, tratada de forma adequada (1,9).
A constipação pode ser decorrente de anormalidades da IEE, cujo componente parassimpático na região do cólon distal e reto é composto basicamente por fibras sacrais pré-ganglionares (41). Malformações do sacro,
freqüentes em portadores de AAR (13 % a 50%), podem afetar tais fibras (1,15).
A denervação do reto, por causa da sua mobilização durante a cirurgia, poderia desencadear um quadro de hipomotilidade retal (6,11,16,17). No entanto, a
constipação é mais freqüente no pós-operatório de AAR consideradas baixas, quando o esperado seria uma maior freqüência nas AAR altas onde se realiza uma maior mobilização. Segundo Rintala (6), a extensa mobilização do reto poderia, também, causar uma denervação sensorial que prejudicaria a sensação de fezes no reto (6). Holschneider et al (14) consideram que a mobilização do reto poderia ser a causa de lesões iatrogênicas da inervação extramural que se localiza anteriormente à fáscia de Denonvilliers, de difícil identificação em recém-nascidos.
A presença de alterações da IEI é assunto controverso entre os autores, que sempre exibiram a preocupação de investigar a presença ou não de células ganglionares em biópsias ou em ressecções cirúrgicas. Em relatos anteriormente mencionados (1,10-13), não foram encontradas anormalidades.
Outros autores, porém, exibem resultados diferentes. Parkkulainen et al (20)
avaliaram a presença de gânglios em 25 portadores de AAR, encontrando aganglionose em 15 deles (60%). Kiesewetter et al (21) realizaram um estudo abrangendo 32 centros de cirurgia pediátrica nos Estados Unidos e Canadá em que avaliaram 296 pacientes, encontrando uma associação com aganglionose em 10 deles (3,4%). Holschneider et al (23) estudando 52 pacientes encontraram padrão de inervação anormal em 49 deles (94%). Méier-Ruge et al (25,42) estudaram 41 pacientes portadores de AAR observando 60% de anomalias do sistema nervoso entérico. De qualquer forma, considerando que a incidência de AAR, assim como a de aganglionose, é de um em cada 5.000 recém-nascidos, seria de esperar que uma combinação dessas duas lesões ocorresse com uma freqüência ainda menor do que as mesmas em suas formas isoladas.
As alterações das CIC, em pacientes portadores de AAR, foram descritas por Kenny et al em 1998 (27). Analisando 12 pacientes portadores de
AAR, encontraram ausência de CIC em dois e diminuição acentuada em cinco. É o único artigo que estuda as CIC em pacientes portadores de AAR. No entanto, anormalidades na densidade e distribuição dessas células já foram descritas na Doença de Hirschsprung e em portadores de constipação crônica do tipo slow transit constipation (32-34).
Baseado nesses dados, o presente trabalho estudou a IEI, através do estudo da população de células ganglionares, e as células intersticiais de Cajal em um modelo experimental de AAR, induzida pela ETU.
Existem três modelos animais de AAR: o proveniente de mutações, o de ocorrência espontânea e o induzido por drogas.
O modelo clássico, e mais antigo, é proveniente de uma mutação: é o camundongo de cauda curta de Danforth (43). Trata-se de uma mutação natural, que apresenta uma série de malformações, entre elas a imperfuração anal.
Mais recentemente, foi descoberto um camundongo com uma mutação envolvendo o gene sonic hedgehog (SHH), que também exibe imperfuração anal em seu fenótipo. O gene sonic hedgehog codifica uma molécula sinalizadora que exerce diversos papéis no desenvolvimento dos vertebrados
(44). São animais de difícil obtenção e extremamente caros.
A ocorrência espontânea de malformações anorretais não é incomum em animais domésticos, especialmente em porcos, com uma incidência ao redor de 0,2%. Apresentam similaridades com as malformações humanas, porém com um baixo índice de malformações associadas (45). Hori e colaboradores (46), em estudo de mapeamento genético, utilizaram porcos com AAR, obtidos através do cruzamento de animais afetados ao longo de 15 anos. Com esse modelo alcançaram uma incidência de 62% de portadores de AAR. A vantagem desse modelo está no tamanho do animal, que permite um estudo anatômico e histológico mais aprofundado. O inconveniente do modelo é o tempo de gestação e a sua manutenção em biotério.
O emprego de drogas indutoras de AAR em pequenos roedores, como o camundongo e o rato, é o modelo experimental mais utilizado. O período de gestação é curto (21 dias) e são de fácil manutenção em biotério. As drogas mais empregadas são: a adriamicina (47); os derivados da vitamina A (48,49) e a
ETU (35-40). A adriamicina é mais utilizada na indução de atresia de esôfago e
provoca uma baixa incidência de AAR (47). Os derivados da vitamina A só
apresentam efeito em camundongos, ao contrário da ETU que só apresenta efeito em ratos. O emprego de ratos proporciona o estudo em fetos maiores, constituindo-se em uma vantagem.
O modelo escolhido foi o da indução de AAR em ratos utilizando a ETU. A ETU é um produto de degradação do etileno-bis-tiocarbonato, formalmente empregada como fungicida agrário, sabidamente teratogênica e carcinogênica em animais de laboratório. Khera, em 1973 (35), e Ruddick e Khera, em 1975
(36), através da administração de ETU a ratas e coelhas grávidas induziram
anomalias em vários órgãos dos fetos gerados. O potencial de gerar AAR foi estudado por Hirai e Kuwabara, em 1990 (37). Os dados obtidos indicaram como dose ideal para indução de AAR 125 mg/kg. As anomalias mais encontradas
foram a fístula reto-uretral no macho e a reto-cloacal na fêmea. Outros trabalhos, como os conduzidos por Qi et als (38), Qi et als (39), Yuan et a (40),
empregando a droga na mesma dosagem alcançaram o mesmo resultado. O método utilizado se mostrou de fácil reprodutibilidade, sendo que 71% dos fetos apresentaram anomalia anorretal, 80% alterações de coluna vertebral e 35% alterações urológicas.
A incidência de AAR foi comparável a de outros trabalhos, que variam de 55 a 85% (37-40). Essa incidência é menor do que a obtida com o emprego de derivados da Vitamina A, em que cerca de 95% da prole apresenta a malformação (48). Os tipos de anomalias encontradas foram similares aos encontradas na espécie humana, porém com incidência diferente: a cloaca foi a alteração mais freqüente (62%), sendo que na espécie humana é um dos tipos mais raros (1,2).
A incidência de 80% de alterações de coluna vertebral foi um pouco mais baixa que a de outros autores que relatam agenesia de cauda ou cauda rudimentar em 100% dos fetos, sendo que 48 a 70% deles, adicionalmente, exibem mielosquise, situação não encontrada nesse estudo (37-40).
Alterações urológicas, que na espécie humana ocorrem entre 13 e 50% dos pacientes, ocorreram em 35% dos fetos, sendo que as principais alterações encontradas foram a agenesia renal (40%) e a ureterohidronefrose (50%), similares à espécie humana.
O estudo das células ganglionares e das CIC foi realizado através do cálculo da densidade celular por milímetros quadrados. Esse método foi utilizado por Wedel em 2002 (34), analisando CIC em pacientes portadores de
megacolo congênito e de constipação crônica. A contagem celular se restringiu à área representada pela camada muscular circular e longitudinal, onde se localiza o plexo mioentérico, já presente no rato recém-nascido (52). As CIC também já podem ser identificadas no rato recém-nascido, e a região em que exibem maior incidência é justamente a parte externa da camada muscular circular (31,50).
Para a pesquisa das CIC foi utilizada a técnica imunohistoquímica com a demonstração de seu receptor tirosina quinase (30-34).
Para a pesquisa de células ganglionares optou-se por método imunohistoquímico para pesquisa da proteína S100. Ferri em 1982 (29), foi
quem primeiro demonstrou que as células gliais entéricas e as células de Schwann no intestino apresentam grande imunoreatividade para a proteína S100. Essa coloração é muito útil pela marcante visualização dos elementos de sustentação das células ganglionares (27). Nesse estudo, associou-se a contracoloração de Harris, para coloração das células ganglionares. Na ausência de células ganglionares, as células de sustentação se distribuem irregularmente ao redor de vasos sanguíneos nas camadas mucosa, submucosa e muscular (28).
Os dados obtidos permitiram o estudo comparativo das células ganglionares e das CIC entre os três grupos de fetos, assim como permitiu a análise dessas células entre os três tipos de anomalia anorretal encontrados.
Os resultados demonstraram diferença estatisticamente significante entre os três grupos de fetos, quando analisados pelo método de análise de variância, quanto à densidade de CIC e quanto à densidade de células ganglionares.
Os resultados também demonstraram diferença estatisticamente significante entre os três grupos de fetos, quando analisados, dois a dois, pelo método de Bonferroni, quanto à densidade de CIC e quanto à densidade de células ganglionares. O grupo Controle externo apresentou uma maior densidade que o grupo Controle interno que por sua vez apresentou maior densidade que o grupo AAR.
Os dois grupos celulares (células ganglionares e CIC) exibiram perfil semelhante. A semelhança entre as densidades dos dois grupos celulares pode ser decorrente da origem das CIC. São células mesenquimais, cujos receptores tirosina quinase (c-Kit) sob a influência de fatores gerados pelas células nervosas do plexo mioentérico, diferenciam-nas em CIC mioentéricas
(30,31).
Não existem trabalhos experimentais relacionando AAR com as CIC, assim como não existem relatos da densidade de CIC em ratos. Wedel em 2002 (34) determinou a densidade das CIC em pacientes adultos normais,
portadores de constipação crônica e portadores de megacolo congênito. Nos pacientes normais encontrou uma densidade de CIC por mm2 de 18,8 ± 3,3 e nos pacientes portadores de megacolo congênito encontrou uma densidade de CIC por mm2 de 6,1 ± 3,2. Curiosamente, e sem efeitos de comparação, essas medidas se aproximam das encontradas no presente estudo, onde os fetos do grupo Controle externo (normais) exibiram uma densidade de 18,97 ± 2,4 e os do grupo AAR 7,07 ± 2,44.
Estudos experimentais correlacionando AAR com estudos de IEI são escassos e empregaram metodologia diferente. Favre et al (51) utilizando a coloração pela proteína neurofilamentar e pelo óxido nítrico sintetase em camundongos de cauda curta de Danforth demonstraram uma associação com hipoganglionose (41%) e aganglionose (58%). Mandhan et al (52) utilizando enolase específica do neurônio e Substância P avaliaram o intestino terminal de ratos recém nascidos portadores de AAR induzida pela ETU, demonstrando diminuição da imunoreatividade em ambos os métodos.
Os resultados obtidos também demonstraram que o grupo Controle interno apesar de não apresentar AAR em seu fenótipo, apresentou uma contagem diminuída de células ganglionares e de CIC, e metade deles apresentou outras malformações. Esse fato pode estar relacionado ao mecanismo de ação da ETU.
Acredita-se que a ETU exerça seus efeitos possivelmente por alterar a sinalização do gene SHH. A molécula codificada pelo gene SHH está envolvida no desenvolvimento de diversos sistemas, entre eles o sistema nervoso, o sistema esquelético, estruturas craniofaciais e o trato gastrintestinal. No trato gastrintestinal, ela é responsável pela regionalização do tubo digestivo primitivo, pelo padrão radial do tubo digestivo, pela diferenciação de suas camadas e pela diferenciação dos neurônios entéricos (53,54,55). Camundongos com mutação do SHH exibem diversos defeitos do trato gastrintestinal semelhante aos humanos, entre eles o pâncreas anular, a estenose duodenal, o megacolo congênito e as AAR.
As alterações encontradas no grupo Controle interno poderiam ter sido desencadeadas por alterações da sinalização do gene SHH, que desencadeou
algumas das alterações encontradas, porém que não tiveram seu efeito pleno ao não induzir a AAR.
Os resultados também indicaram que não houve diferença estatisticamente significante quanto à densidade de células ganglionares e de CIC, entre os três tipos de AAR. Dessa forma, não podemos intuir que os diferentes graus de obstipação que se observa nos diferentes tipos de AAR sejam decorrentes de diferentes densidades dessas células.
Os resultados obtidos demonstram que existem alterações da inervação entérica intrínseca e das células intersticiais de Cajal no intestino terminal de ratos portadores de AAR.
Novas pesquisas podem ser desenvolvidas em modelos experimentais para melhor compreensão das alterações existentes.
6. CONCLUSÕES
1. Existe uma menor densidade de células ganglionares no intestino terminal de ratos portadores de anomalia anorretal induzida pela etilenotiouréia.
2. Existe uma menor densidade de células intersticiais de Cajal no intestino terminal de ratos portadores de anomalia anorretal induzida pela etilenotiouréia
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