et industrielt distrikt med fleksibel spesialisering
3.3 Elektronikkindustrien i Horten – et «new industrial space»
As características de desempenho comummente usadas na validação de uma metodologia analítica são: Especificidade/Seletividade; Estabilidade das Soluções; Linearidade; Precisão (repetibilidade e reprodutibilidade), limites de deteção e quantificação, Exatidão e Robustez (Ferreira, 2013).
VI.3.1.1 – Seletividade
A Seletividade é a capacidade de um método identificar e distinguir um analito em particular numa mistura complexa sem interferência dos outros componentes. Diz-se que um método é específico quando permite discriminar o analito relativamente a outras substâncias, eventualmente presentes na amostra a analisar, ou seja, quando oferece garantias que a grandeza medida provém apenas do analito (Castro, 2000).
Os interferentes da análise poderão ser: compostos adicionados, produto de degradação, impurezas do processo, compostos de síntese, solventes residuais, extratáveis da embalagem, etc; solventes utilizados em laboratório; ou compostos provenientes do tratamento da amostra (Ferreira, 2013).
Para avaliar as interferências poder-se-á realizar um teste de recuperação utilizando uma série de amostras, com a mesma matriz, em que apenas varia a concentração do analito em proporções conhecidas e ao longo de toda a gama de trabalho. Convém que as amostras sejam realizadas em duplicado e em condições de repetibilidade (Castro, 2000).
VI.3.3.2 – Linearidade (Curva de Calibração)
A linearidade é a habilidade do método analítico em produzir resultados que sejam diretamente proporcionais à concentração do analito existente nas amostras, numa determinada gama de trabalho. Esta característica mede a proporcionalidade entre a concentração do analito ou concentração verdadeira com o resultado obtido nas análises. Não basta que a concentração
realmente existente na amostra seja proporcional ao valor encontrado na análise, mas que a curva-padrão tenha repetibilidade constante (Reis, 2006).
Para a correta determinação da linearidade é necessário no mínimo (Ferreira, 2013): 5 Níveis de concentração;
Concentrações igualmente distribuídas ao longo da gama de trabalho; Padrões preparados no mesmo meio que a amostra;
30 Observações:
o Uma Solução-Mãe: 5 níveis de concentração de analito diferentes com 6 leituras por nível;
o Três Soluções-Mãe: 5 níveis de concentração de analito diferentes com 2 leituras por nível de cada solução preparada a partir da correspondente solução-mãe;
Soluções preparadas de modo a se realizar 3 ensaios de linearidade independentes. No estudo da linearidade existe uma grandeza aleatória, chamada de sinal, sendo esta no nosso caso a absorvância, e uma grandeza controlada, no nosso caso a concentração de clorofila. Assim, o valor de r, conhecido por ser o coeficiente de correlação de duas variáveis aleatórias, não possui interpretação pois uma das grandezas é controlada. Deste modo a qualidade da reta é dada pelo coeficiente de determinação r2. Este coeficiente mede a fração da variância de y que
é explicada pela reta de regressão linear. A variância dos valores experimentais de y é composta por duas parcelas (Ferreira, 2013):
Variância não explicada pelo modelo linear – a variância residual que é independente dos valores de x e que mede a dispersão dos valores de y em torno da reta de regressão; Variância explicada pelo modelo linear – a variância das ordenadas y da reta de
ajustamento e, por consequência, dependente de x. A forma algébrica da equação de uma reta é dada por:
𝑦 = 𝑎 + 𝑏 𝑥
Eq.9 Onde a representa a ordenada na origem e b o declive da reta.
A reta é formada por um conjunto de pares ordenados e independentes (x,y). O coeficiente de correlação linear (r) e o coeficiente de determinação (r2) são usados para indicar o quanto a reta
pode ser adequada como modelo matemático e o critério mínimo aceitável do coeficiente de determinação varia entre os guias de validação de 0,90 a 1 (Reis, 2006).
𝐶𝑜𝑒𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝐴𝑛𝑔𝑢𝑙𝑎𝑟 (𝑏) =∑[(𝑥∑(𝑥𝑖− 𝑥̅)(𝑦𝑖− 𝑦̅)] 𝑖− 𝑥̅)2
Eq.10
𝐶𝑜𝑒𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝐿𝑖𝑛𝑒𝑎𝑟 (𝑎) = 𝑦̅ − 𝑏𝑥̅
Eq.11 Onde: 𝑦̅ – Média dos valores de y; 𝑥̅ – Média dos valores de x
Estes coeficientes dão uma estimativa verdadeira da função que é limitada pela dispersão inevitável do método. A precisão da estimativa é quantificada pelo desvio padrão residual da reta de regressão, calculado através da ferramenta de análise estatística do Excel. Este desvio exprime a dispersão dos valores do sinal em torna da curva de calibração. O desvio padrão residual 𝑆𝑦⁄𝑥 (Ferreira, 2013): 𝑆𝑦 𝑥 ⁄ = √∑[𝑦𝑖− (𝑎 + 𝑏𝑥𝑖 )]2 𝑛 − 2 Eq.12 Onde: a – coeficiente linear; b- coeficiente angular; n – número de ensaios realizados
Foi também feita a Anova – Análise de Variância, onde: df – graus de liberdade;
SS – Soma dos Quadrados
MS – Média dos Quadrados ou Variância estimada
F – Se o valor de F>F tablado então deve-se rejeitar a hipótese de não linearidade F de significância é igual ao valor de p, e traduz uma probabilidade estimada de rejeitar
a hipótese nula (H0) quando esta hipótese é verdadeira. Quanto mais pequeno foi o F de
significância melhor o modelo, menor é a probabilidade de ocorrerem situações extremas de não linearidade (Ferreira, 2013).
O desvio padrão da ordenada na origem e do declive, são calculados através das seguintes expressões (Ferreira, 2013): 𝑆𝑎(𝑜𝑟𝑖𝑔𝑒𝑚) = 𝑆𝑦⁄𝑥√ ∑ 𝑥𝑖 2 𝑖 𝑛 ∙ ∑ (𝑥𝑖 𝑖− 𝑥̅)2 Eq.12 Onde: 𝑆𝑦⁄𝑥 – desvio padrão residual; n – número de ensaios realizados; 𝑥̅ – Média dos valores
𝑆𝑏 = 𝑆𝑦 𝑥 ⁄ ∑ (𝑥𝑖 𝑖− 𝑥̅)2 Eq.13 Onde: : 𝑆𝑦 𝑥
⁄ – desvio padrão residual; 𝑥̅ – Média dos valores de x
A partir da função polinomial (y = a+bx) que será calculada no capítulo da linearidade pode-se determinar a concentração da amostra. Assim a incerteza do resultando analítico é a combinação da incerteza associada à determinação do verdadeiro valor e da incerteza associada aos coeficientes de regressão. Para cada valor da concentração existe um intervalo de confiança do verdadeiro valor de y. (Ferreira, 2013)
O desvio padrão do método (Sm) é uma característica que permite ao analista verificar a
qualidade do seu trabalho (Castro, 2000): 𝑆𝑚= 𝑆𝑦 𝑥 ⁄ 𝑏 Eq.14 Onde: 𝑆𝑦 𝑥
⁄ – desvio padrão residual; b – Coeficiente Angular
O coeficiente de variação do método, CVm, expresso em %, é dado por (Castro, 2000):
𝐶𝑉𝑚=𝑆𝑥̅ ∙ 100𝑚
Eq.15 Onde: 𝑆𝑚– Desvio Padrão do Método; 𝑥̅ – Média dos valores de x
VI.3.3.3 – Precisão
A precisão é um termo geral que pretende avaliar a dispersão de resultados entre ensaios independentes, repetidos sobre a mesma amostra, amostras semelhantes ou padrões, em condições definidas. É importante salientar que será mais realista estudar preferencialmente a precisão sobre amostras, para minimizar efeitos de matriz (Castro, 2000).
Consideram-se 3 níveis de precisão: Repetibilidade (equipamento e do método), Precisão Intermédia e Reprodutibilidade (Ferreira, 2013). Contudo os dois níveis mais comuns de avaliar a precisão de um método de ensaio são através da Repetibilidade e da Reprodutibilidade. A
um só analista, com um só procedimento, em um só equipamento e local, num curto período de tempo. Já a reprodutibilidade é usada em validações intra e interlaboratoriais, quando um método vai ser executado por diferentes analistas, por mais de um equipamento e/ou em diferentes (Reis, 2006).
VI.3.3.3.1 - -Repetibilidade
A repetibilidade exprime a precisão de um método de ensaio efetuado em condições idênticas, isto é, refere-se a ensaios efetuados sobre uma mesma amostra, em condições tão estáveis quanto possíveis, tais como: mesmo laboratório, mesmo analista, mesmo equipamento, mesmo tipo de reagentes e em curtos intervalos de tempo. (Castro, 2000)
A repetibilidade do método consiste em analisar num curto espaço de tempo diferentes alíquotas de uma amostra homogénea, cada uma delas preparada e processada de maneira independente. Sendo que por concentração deverão ser processadas e analisadas 3 réplicas independentes. (Ferreira, 2013)
A estimativa da variação (Sr2) de um método de análise pode ser determinada pela média
ponderada das estimativas das variações de w séries de análises estudadas nas condições de repetibilidade. Tendo em conta que a repetibilidade pode variar com o teor do elemento a dosear, esta ultima condições assegura, em princípio, a igualdade estatística das variações de w séries de análise. Assim, a variância associada à repetibilidade do método de ensaio, para cada nível i de concentração é (Castro, 2000): 𝑆𝑟𝑖2 =∑ [(𝑛𝑤𝑖− 1) ∙ 𝑆𝑤𝑖 2 ] 𝑝 𝑤=1 ∑𝑝𝑤=1(𝑛𝑤𝑖− 1) Eq.16 Para um nível de confiança de 95%, o limite de repetibilidade (r) é avaliado segundo (Castro, 2000):
𝑟 = 2,8 ∙ √𝑆𝑟𝑖2
Eq.17 O coeficiente de Variação de Repetibilidade (CVr), para cada nível de concentrações, expresso
em percentagem, é dado por (Castro, 2000):
𝐶𝑉𝑟=𝑆𝑥̅ ∙ 100𝑟𝑖
VI.3.3.3.2 – Reprodutibilidade
A reprodutibilidade refere-se à precisão de um método efetuado em condições de ensaio diferentes, utilizando o mesmo método de ensaio, sobre uma mesma amostra, fazendo-se variar as condições de medição, tais como: diferentes laboratórios, diferentes operadores, diferentes equipamentos e/ou diferentes épocas (Castro, 2000).
O estudo da precisão intermédia pode ser substituído pelo estudo da reprodutibilidade (Ferreira, 2013).
O limite de reprodutividade é o valor abaixo do qual se deve situar, com uma probabilidade específica (normalmente 95%), a diferença absoluta entre os dois resultados de ensaio, obtidos nas condições referidas. (Castro, 2000)
A reprodutibilidade é obtida a partir de ensaios de uma série de amostras aos p analistas, os quais realizam ensaios sobre a mesma amostra. (Castro, 2000)
O valor da variância associada à reprodutibilidade é calculado do seguinte modo (Castro, 2000): 𝑆𝑅𝑖2 = 𝑆𝐿𝑖2 + 𝑆𝑟𝑖2
Eq.19 Sendo 𝑆𝑅𝑖2 – Variância de reprodutibilidade; 𝑆
𝐿𝑖2 – Variância interanalista; e 𝑆𝑟𝑖2 – Variância da repetibilidade. 𝑆𝐿𝑖2 =𝑆𝑑𝑖 2 − 𝑆 𝑟𝑖2 𝑛̿𝑖 Eq.20 𝑆𝑑𝑖2 =𝑝 − 1 ∙ ∑1 𝑛𝑤𝑖 𝑝 𝑤=1 ∙ (𝑛̅̅̅̅̅ − 𝑥𝑤𝑖 ̿)𝑖 2 Eq.21 𝑛̿ =𝑖 𝑝 − 1 ∙ [∑1 𝑛𝑤𝑖 𝑝 𝑤𝑖=1 − ∑𝑝𝑤=1𝑛𝑤𝑖2 ∑𝑝𝑤=1𝑛𝑤𝑖] Eq.22 Sendo 𝑆𝑟𝑖2 – Variância de repetibilidade associada aos resultados considerados, para cada laboratório; 𝑛𝑤𝑖 – nº de ensaio efetuado pelo analista para um determinado nível de concentrações; p – nº de analistas participantes; 𝑥̅ – Média aritmética dada pelo analista para 𝑖 uma determinada nível de concentração.
Para um nível de confiança de 95%, o limite de reprodutibilidade é avaliado segundo (Castro, 2000):
𝑅 = 1,96 ∙ √2 ∙ 𝑆𝑅𝑖
Eq. 23 O Coeficiente de Variação de Reprodutibilidade (CVR), expresso em percentagem, é dado por
(Castro, 2000):
𝐶𝑉𝑅=𝑆𝑥̅ ∙ 100𝑅𝑖
Eq.23
VI.3.4 – Exatidão
A forma de avaliação deste parâmetro baseia-se na comparação do resultado obtido com o verdadeiro valor sendo o analito um analito de referência com concentração conhecida. (Ferreira, 2013)
A exatidão de um método, ou de um resultado, está condicionada pela existência de erros sistemáticos, que se manifestam sempre da mesma maneira, para um dado conjunto de ensaios independentes. Os erros sistemáticos obedecem a causas determinadas e podem ser classificados em três categorias: erros instrumentais, onde estão incluídas a má calibração do material e as avarias parciais do equipamento; erros operativos, onde são incluídos alguns erros dos analistas e erros de método, associados a interferências de ordem variada, à existência de reações secundárias no processo analítico (Ribeiro, 2006).
Para o cálculo da exatidão foi utilizado um analito de referência, sendo feita a fortificação a uma matriz sem analito.
As quantidades adicionadas foram:
0,1 mg de clorofila em 10 ml de diclorometano; 0,2 mg de clorofila em 10 ml de diclorometano;