Eldrevne ferger

A análise bioquímica foi realizada em todos os animais de cada grupo, na parte para o estudo histométrico e para o estudo do torque de remoção.

Durante o experimento foram realizadas cinco determinações bioquímicas, nos seguintes períodos: - antes da cirurgia de instalação dos implantes (Dia 1); - antes da indução do diabetes (Dia 60); - 20 dias após a indução do diabetes (Dia 80); - 40 dias após a indução do diabetes (Dia 100) e - 60 dias após a indução do diabetes (Dia 120). Exceto para o teste de glicemia que também foi realizado o exame 1 dia após a indução do DM.

No plasma foi determinado a concentração de glicose, cálcio, fósforo e fosfatase alcalina. Para isso, 1500 μl de sangue foram coletados de cada animal. A amostra foi centrifugada à 2500 rpm por 10min para a separação do plasma. Todos os exames foram realizados por meio do método colorimétrico utilizando o Kit Labtest Diagnóstica® (Labtest Diagnóstica S.A., Lagoa Santa, Minas Gerais, Brasil), de acordo com as normas do fabricante. Os resultados foram expressos em mg/dL. Os exames foram realizados sempre pelo mesmo operador, previamente treinado. As amostras eram numeradas de forma que o operador desconhecia a que grupo pertencia o animal.

Dois dias antes da coleta do sangue, os animais foram colocados em gaiola metabólica individual permitindo assim, a adaptação dos animais (Figura 21). O objetivo da gaiola metabólica era poder determinar a quantidade de ração e água ingeridas e quantidade de urina excretada por cada animal em 24horas. Além disso, na urina foi determinada a concentração de cálcio e fósforo,

usando o Kit Labtest Diagnóstica® (Labtest Diagnóstica S.A., Lagoa Santa, Minas Gerais, Brasil). Antes da realização dos exames bioquímicos, a urina foi acidificada com ácido clorídrico até atingir um ph entre 1 e 3.

FIGURA 21 – Animal na gaiola metabólica para coleta de urina de 24 horas.

4.10.1 Teste de glicemia

O teste da glicose PAP Liquiform é um sistema enzimático para determinação da glicose no sangue em método colorimétrico. O princípio consiste na capacidade da glicose oxidase catalisar a oxidação da glicose. O peróxido de hidrogênio reage com 4-aminoantipirina e fenol, sob ação catalisadora da peroxidase, através de uma reação oxidativa de acoplamento formando uma antipirilquinonimina vermelha cuja intensidade de cor é proporcional à concentração da glicose na amostra7.

Glicose + O2+H2O Ácido Glucônico + H2O2

H2O2 + 4-Aminoantipirina + fenol Antipirilquinonimina + 4H2O Glicose oxidase

Para o exame foram pipetados 20Pl do plasma e 2000Pl do reagente; no vortex foi realizado a mistura e colocado em banho maria a 37°C durante 15 minutos. Foram realizados três exames utilizando o líquido padrão que contém uma concentração conhecida. A leitura do exame foi feita no espectrofotômetro Femto modelo 660 S com 505Km de comprimento de onda.

Para determinação do valor de glicemia em mg/dL é necessário a realização de um cálculo que consiste inicialmente na determinação do fator. O fator é obtido da divisão de 100 que corresponde a concentração de glicose em g/dL no padrão pela média das 3 absorbâncias (leitura dos três tubos padrões).. O fator é multiplicado pelo valor de absorbância resultante de cada amostra.

Para a interpretação dos resultados, ratos diabéticos apresentam valor de glicemia entre 250-600mg/dL e ratos controle entre 120-160 mg/dL.

4.10.2 Teste da Fosfatase Alcalina (ALP)

O teste da ALP foi realizado nas amostras de plasma dos animais pelo método de medição colorimétrico. O princípio consiste na capacidade da ALP presente no plasma hidrolisar a timolftaleína monofosfato, presente no reagente, liberando timolftaleína, que tem cor azul em meio alcalino. A cor formada é azul e diretamente proporcional à atividade enzimática.

Timolftaleína monofosfato Timolftaleína

Fosfatase alcalina

hidrólise

A técnica consistiu na mistura de 50Pl do substrato e 50Pl da solução tampão, provenientes do kit, e foi colocada em banho maria a 37°C durante 2 minutos. Em seguida foi colocado 50Pl da amostra de plasma na mistura e novamente em banho maria a 37°C durante 10 minutos. E finalmente é adicionado 2000Pl do reagente de cor na mistura. Foram realizados três exames utilizando o líquido padrão que contém uma concentração conhecida. A leitura do exame foi feita no espectrofotômetro Femto modelo 660 S com 590Km de comprimento de onda.

Para determinação do valor de ALP U/L é necessário a realização de um cálculo que consiste inicialmente na determinação do fator. O fator é obtido da divisão de 45 que corresponde a concentração de ALP em g/dL no padrão pela média das 3 absorbâncias (leitura dos três tubos padrões). O fator é multiplicado pelo valor de absorbância resultante de cada amostra.

4.10.3 Teste de Cálcio (Ca)

O teste de cálcio foi realizado nas amostras de sangue e de urina acidificada pelo método colorimétrico. O princípio consiste no cálcio reagir com a púrpura de ftaleína em meio alcalino formando um complexo de cor violeta.

Nesse exame foi feito uma mistura com duas partes do reagente 1 e uma parte do reagente 2. A leitura do exame foi feita no espectrofotômetro com

570Km de comprimento de onda. Foi colocado 1ml da mistura na cubeta do espectrofotômetro, após zerar o aparelho, 20 Pl da amostra, sangue ou urina acidificada, foi adicionada na cubeta e então determinado o valor de absorbância. Foram realizados três exames utilizando o líquido padrão que contém uma concentração conhecida. A leitura do exame foi feita no espectrofotômetro Femto modelo 660 S com 570Km de comprimento de onda.

Para determinação do valor de Ca no sangue em mg/dL é necessário a realização de um cálculo que consiste inicialmente na determinação do fator. O fator é obtido da divisão de 10 que corresponde a concentração de Ca em g/dL no padrão pela média das 3 absorbâncias (leitura dos três tubos padrões). O fator é multiplicado pelo valor de absorbância resultante de cada amostra. Para determinação do valor de Ca na urina de 24h, é multiplicado o valor do exame pelo volume da urina e dividido por 100. O resultado do cálcio urinário é expresso em mg/24horas.100g peso corporal.

4.10.4 Teste de Fósforo (P)

O teste de fósforo foi realizado nas amostras de sangue e de urina acidificada (1:10) pelo sistema de reação de ponto final. O princípio consiste na reação dos íons de fosfato da amostra com o molibdênio em meio ácido formando um complexo amarelo, o qual, por ação de um tampão alcalino é reduzido a azul- molibdênio que é medido colorimetricamente.

O exame consistiu na associação de 2000Pl de água destilada, 100Pl da amostra e 1 gota do catalisador; após a mistura, foi adicionado 1 gota do reagente molibdato; banho de água fria (20-25°C) durante 3 minutos ; adicionar 2 gotas de tampão e colocar em banho de água fria (20-25°C) durante 5 minutos. Foram realizados três exames utilizando o líquido padrão que contém uma concentração conhecida. A leitura do exame foi feita no espectrofotômetro Femto modelo 660 S com 650Km de comprimento de onda.

Para determinação do valor de P no sangue em mg/dL é necessário a realização de um cálculo que consiste inicialmente na determinação do fator. O fator é obtido da divisão de 5 que corresponde a concentração de P em g/dL no padrão pela média das 3 absorbâncias (leitura dos três tubos padrões). O fator é multiplicado pelo valor de absorbância resultante de cada amostra. Para determinação do valor de P na urina de 24h, é multiplicado o valor do exame pelo volume da urina e dividido por 100. O resultado do cálcio urinário é expresso em mg/24horas.100g peso corporal.

Complexo azul-molibdênio

Fósforo + molibdênio Complexo amarelo + meio alcalino inorgânico

4.11 Análise histométrica