Importante progresso na compreensão da sinalização de resposta celular por formas R e S de LPS foi alcançado recentemente. Demonstrou-se, a partir de camundongos geneticamente modificados, que a forma R de LPS poderia induzir sinalização celular de forma independente de CD14. Esta sinalização ocorreria pela via dependente de MyD88. A forma R de LPS, assim como o sLPS, também pode se acoplar a CD14/MD2/TLR4 induzindo sinalização por via MyD88 dependente e independente. Em contraste, a forma S de LPS dependeria do CD14 para efetivamente induzir sinalização celular(70, 71) (figura 1.6). Lipídeo A e rLPS são capazes de ativar TLR4/MD-2 sem CD14, enquanto a forma S de LPS requer CD14(15).
CD14-independente
CD14-dependente
Respostas
independentes
de MyD88
Respostas
dependentes
de MyD88
sLPS ou rLPS rLPS MD-2 TLR4 TRIF TRAM Mal MyD88 NF-kB IRF-3 TNF IFN CD14Figura 1.6: Sinalização dependente e independente de CD14. O complexo TLR4-MD2 pode se ligar à forma R, mas não à forma S de LPS sem a necessidade de CD14. A sinalização por este complexo é limitada à via dependente de MyD88, usando os adaptadores Mal e MyD88 para ativar NFκB. O complexo TLR4-MD2 pode se ligará ambas as formas (r e sLPS) em um processo dependente de CD14. Adicionando-se aos sinais dependentes de MyD88, este complexo também pode ativar respostas independentes de MyD88 via TRAM e TRIF, levando à ativação de IRF-3 (adaptado de Godowski(71)).
Para sinalização através de via independente de MyD88, entretanto, CD14 é necessário tanto para r quanto para sLPS(70). Estes estudos ajudam a compreender a resposta celular induzida
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por LPS em células desprovidas de CD14 na superfície. Este é o caso de células como mastócitos, onde a forma R induziu maior atividade que a forma S(15). Obviamente, deve-se considerar que preparações de forma S de LPS são heterogêneas e apresentam conteúdo de estruturas de forma R, como é classicamente demonstrada em eletroforese por gel de agarose.
Outro estudo mostrou que quanto maior a quantidade de carboidratos retirada do sLPS, maior o decaimento da sensibilidade de macrófagos de camundongos CD14+/+ (em até 500 vezes). Em contraste, macrófagos CD14-/- são incapazes de distinguir entre sLPS e suas várias estruturas parciais, além de serem muito menos sensíveis ao sLPS quando comparados àqueles que expressam o CD14(72).
Há enorme interesse na melhor compreensão da resposta de neutrófilos ao LPS. Como se sabe, estas células expressam muito menos CD14 em sua superfície que os monócitos, todavia são extremamente sensíveis à ação do LPS(6). É de grande importância então estudar a dinâmica da expressão de CD14 nesta célula, ao mesmo tempo em que se compara a ação de forma R e S de LPS em monócitos e neutrófilos do sangue periférico.
Neste estudo avaliamos a expressão de CXCR2, um receptor envolvido no processo de quimiotaxia de neutrófilos, TLR2 e TLR4, os PRRs de bactérias gram-positivas e gram-negativas, CD66b, uma selectina com funções de sinalização(73), e CD11b e CD11c, integrinas envolvidas em adesão a células endoteliais, assim como na sinalização a LPS(74). A atividade de neutrófilos também foi avaliada pela geração de EROs e de NO, e a ativação de proteínas de sinalização. Também analisamos os mesmos receptores em monócitos, incluindo o CD14 e HLADR, além do metabolismo oxidativo, produção de NO e ativação de proteínas de sinalização.
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Após explanação inicial, os objetivos do presente trabalho foram:
• Objetivo geral:
Comparar a ação biológica de formas R e S de LPS em neutrófilos e monócitos do sangue periférico de humanos sadios.
• Os objetivos específicos foram avaliar a resposta ao R e S de LPS quanto a:
1. Dinâmica da expressão dos receptores CD14, CD66b, TLR2, TLR4, CXCR2, HLADR, CD11b e CD11c na superfície de monócitos e granulócitos.
2. Indução de produção de espécies reativas de oxigênio em neutrófilos.
3. Produção de óxido nítrico em monócitos e neutrófilos.
4. Indução de ativação de p38 em monócitos e neutrófilos.
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3.1 Anticorpos
Tabela 3.1: Lista de anticorpos utilizados no estudo.
Anticorpo Quantidade (µl)
Clone Isotipo Fabricante
CD66b FITC1 5 G1OF5 mIgM BD Bioscience Pharmingen
CD11c APC2 2 S-HCL-3 mIgG2b BD Bioscience
CD11b APC 2 D12 mIgG2a BD Bioscience
CD14 PerCP3 6 MφP9 mIgG2b BD Bioscience
CXCR2 APC 3 6C6 mIgG1 BD Bioscience Pharmingen
HLA-DR PE4 2 27-35 mIgG2b BD Bioscience Pharmingen
TLR2 PE 10 TL2.1 mIgG2a eBioscience
TLR4 PE 20 HTA125 mIgG2a eBioscience
TNF-α APC 50 uL (1:100)* MAb11 mIgG1 BD Bioscience Pharmingen
IL10 APC 50 uL (1:50)* JES3-19F1 rIgG2a BD Bioscience Pharmingen
IL8 PE 15uL AS14 mIgG1 BD Bioscience
IL6 PE 10 uL AS12 mIgG1 BD Bioscience
CD14 PE 5uL M5E2 mIgG2a BD Bioscience Pharmingen
CD15 APC 4uL HI98 mIgM BD Bioscience Pharmingen
p50 PE 10 uL sc-8414 IgG1 Santa Cruz Biotechnology
p65 PE 10 uL sc-8008 IgG1 Santa Cruz Biotechnology
1. FITC: fluoresceína isotiocianato 2. APC: aloficocianina
3. PerCP: clorofila peridinina 4. PE: ficoeritrina
* anticorpos diluídos em tampão de permeabilização.
3.2 Aparelhos e Softwares • BD FACSCalibur (BD Bioscences)
• BD FACSCanto (BD Bioscences)
• Cell QuestTM Software versão 3.3 (BD Biosciences)
• Centrífuga 5403 (Eppendorf)
• Centrífuga citológica modelo 248 (Fanem)
• FACSDiva Software versão 4.1 (BD Bioscences)
• FCAP Array Software versão 1.0.1 (BD Bioscences)
• HP Workstation XW4200 (Microsoft)
• Image Pro 6.0 (Microsoft)
• Leitor Multiscan EX (Labsystems)
• Macintosh Power PC, modelo G4 (Apple Computer Inc.)
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EF
• Microscópio de fluorescência Olympus BX51 equipado com módulo de epifluorescência e régua de filtros para DAPI, FITC e Texas Red. Câmera acoplada DP71 (Olympus)
• Microsoft Office Excel 2003 (Microsoft)
• Sistema de captura de imagem AxioVision Rel.4.2 acoplado ao microscópio AxioLab Standart 2.0 (Carl Zeiss)
• Sonicador VC 130 (Sonics & Materials Inc.)
• Vórtex MS1 Minishaker (IKA)
3.3 Reagentes e estímulos
• 7-AAD (BD Bioscience Pharmingen)
• DAPI I (Abbott Molecular Inc)
• Entellan (Merck)
• Faloidina-FITC, gentilmente doada pelo laboratório de Parasitologia da Disciplina de MicroImunoParasito da Universidade Federal de São Paulo
• Ficoll-paque plus (Amersham Bioscience)
• Fosfo-ERK1/2 (T202/Y204) Flex Set (BD Bioscences)
Padrão, Reagente de detecção e Bead de captura (posição C4) para a referida proteína
• Fosfo-p38 (T180/Y182) Flex Set (BD Bioscences)
Padrão, Reagente de detecção e Bead de captura (posição B5) para a referida proteína
• Fosfo-JNK1/2 (T183/Y185) Flex Set (BD Bioscences)
Padrão, Reagente de detecção e Bead de captura (posição B6) para a referida proteína
• LPS de Salmonella abortus equi (LPS forma S) e Salmonella minnesota (LPS forma Re) Obtidos pelo método do fenol-água e purificado com fenol, clorofórmio e éter de petróleo, gentilmente cedidos pelo Dr Chris Galanos, Instituto Max-Planck de Imunobiologia, Freiburg, Alemanha(11).
• PMA (forbol 12-miristato 13-acetato) (Sigma)
• Reagente de Bradford (BioRad)
• Reagentes do kit Cell Signaling Master Buffer Kit (BD Bioscences)
tampão de denaturação; tampão de lavagem C; diluente de ensaio; diluente de partículas de captura; diluente de reagente de detecção; partículas de calibração do citômetro (A1, F1, PE-F1, A9 e F9)
• Staphylococcus aureus, gentilmente doado por Dra. Aparecida Dalboni, da Disciplina de Nefrologia da Universidade Federal de São Paulo
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ED
• Solução fisiológica de NaCl a 0,9% estéril (Áster)
• Solução de inibidor de tripsina 1x (Sigma)
• Solução de lise BDTM (BD Bioscences)
• Soro AB humano (Valley Biomedical, Inc.)
3.4 Soluções e meio de cultura