iDC iDC+APO iDC+HAPO mDC mDC+APO mDC+HAPO
0 25 50 75 p g/ m L *** P<0.0001
Fig. 16. Gráfico de dispersão individual da produção de IL-12p70 no sobrenadante de células dendríticas derivadas in vitro de monócitos de doadores saudáveis na presença de 37i ou 43i autólogas por 48h (ANOVA para Medidas Repetidas, seguido de Teste de Dunett para comparações múltiplas vs iDC). p<0,01, p<0,05.
5.9 Presença de IL-10 no sobrenadante das culturas de DCs com diferentes estímulos.
iDC iDC+37i iDC+43i mDC mDC+37i mDC+43i
0 100 200 300 * * pg /m L
Fig. 17. Gráfico de dispersão individual da produção de IL-10 no sobrenadante de células dendríticas derivadas in vitro de monócitos de doadores saudáveis na presença de 37i ou 43i autólogas por 48h (ANOVA para Medidas Repetidas, seguido de Teste de Dunett para comparações múltiplas vs iDC). p<0,01 vs iDC ou vs mDC.
O nosso próximo objetivo foi analisar se as DCs poderiam ser moduladas diferentemente nas coculturas com 37i ou 43i, através da produção de citocinas moduladoras, como a IL-10 ou pró-inflamatórias, como a IL-12. Como se pode observar na figura 16, houve um aumento significante da produção de IL-12p70 no grupo de mDCs+HAPO, havendo uma tendência para presença dessa citocina no grupo mDC+APO, que no entanto, não se revelou estatisticamente significante. Em
contraste, quando se analisou o sobrenadante das mesmas culturas para a presença de IL-10, observou-se que houve predominância dessa citocina nos grupos não tratados com TNF ou tratados somente com TNF, sugerindo uma correlação inversa com os níveis de IL-12p70 presentes no sobrenadante dessas coculturas. É interessante notar que os níveis significantemente elevados de IL-10 no grupo iDC+37i correlacionaram-se com os níveis aumentados de CD1a e baixos níveis de IL-12p70.
Em conjunto, os resultados de expressão de moléculas de superfície e de produção de citocinas são uma evidência indireta de que houve eliminação de células apoptóticas do meio, provavelmente por fagocitose. A menor expressão de CD14 nas diversas culturas de DCs apresentadas indica que a remoção dessas células apoptóticas pode ter ocorrido por mecanismos independentes da expressão de CD14.
Como será discutido posteriormente, há vários receptores “scavenger” que poderiam
estar envolvidos nesse processo. Os resultados sugerem também que, mesmo com uma taxa de apoptose das HAPO (<40%) menor do que APO (>80%), a quantidade de linfócitos apoptóticos acrescentados, em torno de 10%, não interferiu com a capacidade das iDCs de eliminarem essas células apoptóticas da cultura.
Entretanto, quando as DCs foram tratadas com TNF-α, as células apoptóticas aquecidas presentes não foram capazes de impedir a produção de IL-12 no meio, sugerindo que o processo de fagocitose e eliminação destas células teria ficado prejudicado na presença de DCs maduras, uma vez que estas células têm menor capacidade fagocitária que as imaturas (BANCHEREAU et al, 2000; STEINMAN et al, 2003; MELLMAN et al, 2005). Sugerimos que esse efeito poderia ser correlacionado à própria alteração fenotípica e de membrana das CNAs aquecidas e irradiadas (Figuras 5, 6 e 7), o que faria com que elas fossem detectadas de maneira diferente das CNAs somente irradiadas. Entretanto, mesmo na presença de TNF, estas células apoptóticas pareceram capazes de modular a diferenciação de DCs induzindo proliferação dos linfócitos T, porém, induzindo liberação de níveis menores de IL-12 que o grupo mDC+HAPO, o que parece correlacionar com os níveis de IL-10 presentes nos sobrenadantes no 7º dia de cultura.
Outra hipótese alternativa para explicar estes dados poderia ser simplesmente a quantidade de células apoptóticas presentes nesse grupo, equivalente a cerca de 50% das células apoptóticas presentes no grupo APO, indicando haver um limiar de
resposta a estímulos pró-inflamatórios (TNF-α, ou outros liberados no meio pelas células aquecidas que eventualmente possam se romper) ou manter-se imaturas, pelo menos temporariamente, para continuar a função de limpeza do ambiente pela eliminação de células apoptóticas por fagocitose. Contribui para esta hipótese o fato de que detectamos TNF na cocultura iDCs+HAPO, não verificada nos grupos iDC ou iDC+APO, uma vez que nestes grupos não houve adição de TNF para maturação, enquanto que nos grupos em que adicionamos TNF, a presença desta citocina foi detectada (dados em Anexo).
Não podemos descartar também a hipótese de que ambos os fatores, diferentes alterações fenotípicas de CNAs estressadas de diferentes maneiras e quantidades diferentes de células apoptóticas presentes nesses dois grupos, possam estar associados e tenham efeito sinérgico sobre a maturação das DCs.
Os diferentes resultados mostrados (fenótipo de superfície, expressão de CCR7, indução de proliferação e secreção de citocinas) parecem indicar que DCs continuam apresentando características de maturação mesmo na presença de células apoptóticas, mas que essa maturação fornece características fenotípicas e funcionais diferentes dependendo do grupo em questão. Estes resultados refletem a heterogeneidade fenotípica das DCs, a diversidade de subpopulações presentes e a plasticidade das DCs de responder diferencialmente aos diversos estímulos no microambiente de cultura e, provavelmente, também no microambiente tecidual in
vivo, como proposto e já bastante estabelecido na literatura para DCs humanas em
modelos de infecção e câncer e respectivos protocolos imunoterapêuticos (BANCHEREAU et al, 2000; STEINMAN et al, 2003). Agora, mais recentemente, estes dados são reforçados cada vez mais claramente pelas evidências de que estruturas próprias alteradas podem influir na resposta imune, na ausência de um agente infeccioso conhecido, como demonstramos aqui, e como relatado por Kono e Rock (2008).
Como já mencionado e será melhor discutido adiante, defeitos na eliminação de células apoptóticas, sugeridos por nossos experimentos, já foram demonstrados por Hund et al. (2006), que estudaram pacientes com Síndrome Linfoproliferativa Auto- imune (ALPS). Esses defeitos, associados à nossa detecção de aumento na produção de IL-12, por sua vez associada à presença de DCs (NAKAMURA et al, 2004), estão relacionados ao desencadeamento de doenças auto-imunes, como Lúpus Eritematoso
Sistêmico (LES; HERRMANN et al, 1998) e tireoidite auto-imune (NAKAMURA et al, 2004), e imunodeficiências, como ALPS.
É possível que as moléculas CD1a estejam participando ativamente deste processo de regulação ou modulação, mas a baixa freqüência de polimorfismos desta molécula sugere que boa parte das variações observadas sejam moduladas pela variação ambiental, como por exemplo, pela composição dos lipídios da dieta individual, do soro ou do meio de cultura.
Em resumo, nossos resultados sobre a correlação inversa de IL-10 com os outros parâmetros medidos, associados a dados de literatura sobre a alterações no fenótipo e na presença de linfócitos T reguladores (HUND et al, 2006; NAKAMURA
et al, 2004), reforçam e apóiam a nossa proposta de desenvolvimento de um modelo