2. Methods
3.2 Population range and disereteness
3.2.5 Eastem limit
R eceptor
T ipo
Expresso em
DnaK
T L R 2
Sinalização DCs, Monócitos, Mɸ
s, Mastócitos -T L R 4
Sinalização DCs, Monócitos, Mɸ
s, Mastócitos -DC-SIGN
C-type lectin DCs -m M GL 2
C-type lectin DCs, Mɸ
s +Dectin-1
C-type lectin DCs, Monócitos, Mɸ
s, células B +Siglec-E
I-type lectin Nɸ
s, Mɸ
s, DCs, NK +++L OX -1
Scavenger DCs, Mɸ
s, células B +++SR EC-I
Scavenger DCs, Monócitos, Mɸ
s +SR -A
Scavenger DCs, Mɸ
s -113
A Figura 1 mostra que a DnaK foi capaz de se ligar, nas células que expressam LOX-1, provavelmente com alta afinidade. A DnaK também se ligou, de forma mais fraca e provavelmente com menor afinidade, as células que expressavam SREC-I. Nenhuma ligação da DnaK foi visualizada nas células que expressavam DC-SIGN ou FEEL-1, nem nas células controle
–
transfectadas com o plasmídeo vazio (CHO-pcDNA).Figura 1. A DnaK de M. tuberculosis (Hsp70) se liga a células CHO expressando o receptor L OX -1. Células
CHO-pcDNA, CHO-SREC-1, CHO-LOX-1, CHO-DC-SIGN e CHO-FEEL-1 foram tratadas com 10 µg/ml de DnaK marcada com o corante Alexa 594 por 20 min, no gelo. Posteriormente, as células foram fixadas, coradas com DAPI e analisadas por microscopia Confocal.
114
A ligação da DnaK nas células expressando o LOX-1 e o SREC-I foi confirmada utilizando-se a técnica de citometria de fluxo (Figura 2).
Figura 2. A DnaK de M. tuberculosis (Hsp70) se liga a células CHO expressando o receptor L OX -1 e SR EC-I.
Células CHO-pcDNA (controle), CHO-SREC-1 ou CHO-LOX-1 foram tratadas com 10 µg/ml de DnaK marcada com o corante Alexa 488 por 20 min, no gelo. Posteriormente, as células foram fixadas e analisadas por citometria de fluxo.
115
Os receptores LOX-1 e SREC-I são receptores que desencadeiam respostas pro- inflamatórias (103, 140). Porém, os efeitos reportados por nos pela DnaK são anti-inflamatórios. Com isso, testamos se a DnaK estaria se ligando em dois receptores previamente descritos como anti-inflamatórios
–
Dectin-1 (141) e mMGL2 (142). Contudo, vimos que a DnaK não foi capaz de se ligar em células CHO expressando os receptores Dectin-1 e mMGL2 (Figura 3).Figura 3. A DnaK não se liga diretamente aos receptores Dectin-1 e mM GL 2. Células CHO foram transfectadas
com os plasmídeos Dectin-1-YFP ou mMGL2-YFP (ambos verdes) e posteriormente tratadas com 10 µg/ml de DnaK marcada com o corante Alexa 594 por 20 min, no gelo. Posteriormente, as células foram fixadas, coradas com DAPI e analisadas por microscopia Confocal.
116
Os efeitos da DnaK em células dendríticas foram demonstrados ao longo dos anos pelo nosso grupo (20, 21). Esse efeito foi dependente do TLR2 (22) e independente do TLR4 (não publicado ainda
–
Capitulo 3). Portanto, verificamos se a DnaK poderia se ligar ao TLR2 diretamente ou usa-lo como um co-receptor para enviar os sinais intracelulares. Na Figura 4 mostramos que a DnaK não foi capaz de se ligar em células CHO expressando o receptor TLR2. O mesmo aconteceu para o receptor TLR4 (não mostrado).Figura 4. A DnaK não se liga diretamente no T L R 2. Células CHO foram transfectadas com o plasmídeo TLR2-
YFP (verde) e posteriormente tratadas com 10 µg/ml de DnaK marcada com o corante Alexa 594 por 20 min, no gelo. Posteriormente, as células foram fixadas, coradas com DAPI e analisadas por microscopia Confocal.
117
Após a analise de receptores em células CHO, verificamos se a DnaK poderia se ligar aos mesmo receptores em células dendríticas isoladas de linfonodos e bacos camundongos, em condições mais fisiológicas. Verificamos que a DnaK foi capaz de se ligar na superfície (tratamento feito a 4°C) dessas células e que esta co-localizada com a expressão de LOX-1 na superfície (Figura 5). Os receptores testados tem a característica de serem receptores endocíticos, mediando endocitose após sua ligação. Para testar se a DnaK seria endocitada via LOX-1, tratamos as células com a DnaK a 4°C e posteriormente colocamos as células a 37°C. A figura 5 mostra que a DnaK esta co-localizada com o LOX-1 em vesículas intracelulares, o que sugere que ela pode ser endocitada via esse receptor.
Figura 5. A DnaK co-localiza com o L OX -1 na m em brana de células dendríticas de cam undongos. Células
dendríticas de camundongos foram isoladas do baço e linfonodos e colocadas para aderir em lamínulas por 48h. Após isso, as células foram tratadas com 10 µg/ml de DnaK marcada com o corante Alexa 488 por 20 min, no gelo. Posteriormente, as células foram fixadas, coradas com DAPI e anticorpos para LOX -1 e analisadas por microscopia Confocal. Para a analise de internalização, depois da marcação no gelo, as células foram deixadas 37°C por 20 min, fixadas, coradas com DAPI e anticorpos para LOX-1 e analisadas por microscopia Confocal.
118
Recentemente, a Hsp70 humana foi descrita como ligante de receptores Siglecs (72), uma família de receptores anti-inflamatórios que inibem as respostas via TLRs (143). Testamos se a DnaK se liga no Siglec-E - isoforma expressa por células dendríticas em camundongos (144). Verificamos que a DnaK foi capaz de co-localizar com o Siglec-E na membrana de células dendríticas de camundongos (Figura 6). Além disso, quando essas células foram deixadas a 37°C, a DnaK se co-localizou com o Siglec-E em vesículas intracelulares.
Figura 6. A DnaK co-localiza com o Siglec-E na m em brana de células dendríticas de camundongos. Células
dendríticas de camundongos foram isoladas do baço e linfonodos e colocadas para aderir em lamínulas por 48h. Após isso, as células foram tratadas com 10 µg/ml de DnaK marcada com o corante Alexa 594 por 20 min, no gelo. Posteriormente, as células foram fixadas, coradas com DAPI e anticorpos para o Siglec -E e analisadas por microscopia Confocal. Para a analise de internalização, depois da marcação no gelo, as células foram deixadas 37°C por 20 min, fixadas, coradas com DAPI e anticorpos para Siglec-E e analisadas por microscopia Confocal.
119
Posteriormente, nos perguntamos se o LOX-1 estava fazendo um complexo com o Siglec-E. Vimos que a DnaK co-localizava com o LOX-1 e Siglec-E, formando um grande complexo na membrana das DCs (Figura 7). Além disso, quando as células foram colocadas a 37°C, esse complexo foi todo internalizado, formando uma grande vesícula intracelular (seta branca - Figura 8).
Figura 7. A DnaK co-localiza com o com plexo L OX -1/Siglec-E na m em brana de células dendríticas de camundongos. Células dendríticas de camundongos foram isoladas do baço e linfonodos e colocadas para aderir em
lamínulas por 48h. Após isso, as células foram tratadas com 10 µg/ml de DnaK marcada com o corante Alexa 594 por 20 min, no gelo. Posteriormente, as células foram fixadas, coradas com DAPI e anticorpos para o Siglec-E e LOX-1 e, analisadas por microscopia Confocal.
120
Figura 8. A DnaK co-localiza com o com plexo L OX -1/Siglec-E em vesículas intracelulares em células dendríticas de cam undongos. Células dendríticas de camundongos foram isoladas do baço e linfonodos e
colocadas para aderir em lamínulas por 48h. Após isso, as células foram tratadas com 10 µg/ml de DnaK marcada com o corante Alexa 594 por 20 min, no gelo. Posteriormente, as células foram deixadas 37°C por 20 min, fixadas, coradas com DAPI e anticorpos para o Siglec-E e LOX-1 e, analisadas por microscopia Confocal.
121
Também observamos que o TLR2 estava no complexo com a DnaK e o Siglec-E (Figura 9) e o mesmo foi endocitado (Figura 10). Assim como o Siglec-E, o TLR2 também estava co- localizado com o LOX-1 e a DnaK nas células dendríticas (Figura 11).
Figura 9. A DnaK co-localiza com o com plexo Siglec-E/T L R 2 na m em brana de células dendríticas de camundongos. Células dendríticas de camundongos foram isoladas do baço e linfonodos e colocadas para aderir em
lamínulas por 48h. Após isso, as células foram tratadas com 10 µg/ml de DnaK marcada com o corante Alexa 594 por 20 min, no gelo. Posteriormente, as células foram fixadas, coradas com DAPI e anticorpos para o Siglec -E e TLR2 e, analisadas por microscopia Confocal.
122
Figura 10. A DnaK co-localiza com o com plexo Siglec-E/T L R 2 em vesículas intracelulares em células dendríticas de cam undongos. Células dendríticas de camundongos foram isoladas do baço e linfonodos e
colocadas para aderir em lamínulas por 48h. Após isso, as células foram tratadas com 10 µg/ml de DnaK marcada com o corante Alexa 594 por 20 min, no gelo. Posteriormente, as células foram deixadas 37°C por 20 min, fixadas, coradas com DAPI e anticorpos para o Siglec-E e TLR2 e, analisadas por microscopia Confocal.
123
Figura 11. A DnaK co-localiza com o com plexo L OX -1/T L R 2 em vesículas intracelulares em células dendríticas de cam undongos. Células dendríticas de camundongos foram isoladas do baço e linfonodos e
colocadas para aderir em lamínulas por 48h. Após isso, as células foram tratadas com 10 µg/ml de DnaK marcada com o corante Alexa 594 por 20 min, no gelo. Posteriormente, as células foram deixadas 37°C por 20 min, fixadas, coradas com DAPI e anticorpos para o LOX-1 e TLR2 e, analisadas por microscopia Confocal.
124
O receptor SR-A foi descrito como um receptor para Hsps e possui um efeito supressor das respostas inflamatórias desencadeadas pelo TLR4 (145). Portanto, testamos a co-localização da DnaK com SR-A em DCs de camundongos. Na Figura 12 demonstramos que a DnaK não co- localiza com células expressando SR-A.
Figura 12. A DnaK não co-localiza com o receptor SR -A em células dendríticas de camundongos. Células
dendríticas de camundongos foram isoladas do baço e linfonodos e colocadas para aderir em lamínulas por 48h. Após isso, as células foram tratadas com 10 µg/ml de DnaK marcada com o corante Alexa 594 por 20 min, no gelo. Posteriormente, as células foram fixadas, coradas com DAPI, marcadas com anticorpos para o SR-A e analisadas por microscopia Confocal.
Portanto, nossos dados indicam que a DnaK esta co-localizando com o complexo Siglec- E/LOX-1/TLR2, o qual pode ser todo endocitado por células dendríticas de camundongos.
125
A DnaK pode tolerizar células dendríticas de camundongos através da diminuição do MHC II e do CD80. Testamos se esse efeito é dependente do LOX-1. Para isso, tratamos células dendríticas (DCs) de animais WT ou LOX-1 KO com a DnaK ou controle por 24h. Depois analisamos os níveis de MHC II e CD80 por citometria de fluxo. Vimos que os efeitos da DnaK nas DCs foi independente do LOX-1 (Figura 13).
Figura 13. Os efeitos da DnaK são independentes da expressão de L OX -1 pelas células dendríticas. Células
dendríticas foram isoladas de linfonodos e baco de animais selvagens (WT) ou LOX-1 KO e tratadas com a DnaK ou controle por 24h. Após isso, os níveis de MHC II e CD80 foram avaliados por citometria de fluxo.
Não conseguimos analisar o papel do Siglec-E nos efeitos anti-inflamatórios da DnaK, antes do termino do período de Doutorado sanduiche. Porém, isso será feito posteriormente por outro pesquisador.
126
Discussão
Alguns trabalhos têm demonstrado que membros da família Hsp70 tem um papel anti- inflamatório e protetor em modelos animais experimentais como artrite (87, 88, 146, 147), colite (90), fibrose pulmonar (91) e danos cerebrais (148). Por outro lado, a Hsp70 vem sendo utilizada como vacina para o combate de tumores (111, 112). Nesses estudos, a Hsp70 pode facilitar o processamento e a apresentação de antígenos tumorais fusionados com ela, gerando respostas mediadas por células T CD8+ efetoras (113, 114). A Hsp70 com antígenos tumorais pode se ligar a receptores endocíticos presentes na superfície das células dendríticas, modulando essas células para um fenótipo maduro capaz de fazer apresentação cruzada (antígenos capturados no meio extracelular são apresentados no MHC I), gerando uma resposta T CD8+ efetora e diminuindo o tamanho tumoral. Uma das possíveis explicações para esses efeitos dicotômicos é o fato desses trabalhos não utilizarem a mesma fonte de proteína, ou proteínas recombinantes produzidas em diferentes sistemas experimentais. Outra possível explicação seria a natureza dos receptores inatos que essas proteínas podem se ligar e os complexos que esses receptores formam entre si.
Demonstramos que a DnaK de