A seguir, é apresentado na Figura 73 o espectro Raman de anti-IgGh (Fab2)
35 mg mL-1 e a Tabela 20 com as atribuições das principais bandas Raman.
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 Int en sidad e Ra ma n ( u.a .) Deslocamento Raman (cm-1) Anti-IgGh (F(ab)2) 541 760 858 913 9271005 1127 1144 1156 1342 1460 1670 642
Tabela 20 – Bandas Raman e atribuições para anti-IgGh (Fab2) concentrada.
Deslocamento
Raman (cm-1) Intensidade Atribuição Aminoácido
541 f, ampla S–S1 Met, Cys
642 f – Tyr2
760 f – Tyr2
858 f respiração do anel7 Tyr
913 f – – 927 f CH32 – 1005 m – Phe2 1127 f (C–C) ou (C–N) alquil2 1144 f 1156 f 1342 f (anel) 3,4,5,6 C–H8 Trp 1460 F (CH2)7 Trp 1670 m (C=O)1 Asp
mf = muito fraca; f = fraca; m = média; F = forte; MF = muito forte; = estiramento; = deformação 1 = GNIADECKA et al., 1998
2 = KENGNE-MOMO et al., 2012 3 = AREÂS & KAWANO, 1991; 4 = GRABBE & BUCK, 1989;
5 = STEWART & FREDERICKS, 1999; 6 = PEZOLET et al., 1976;
7 = ZHANG et al., 2008.
Em termos estruturais, pode-se identificar a banda Amida I em 1670 cm-1
devido ao estiramento de C=O (80%), correspondente à estrutura secundária folha- , conforme consta na literatura (AREÂS & KAWANO, 1λλ1).
Assim como foi observado no espectro Raman de anti-IgGh (H+L), uma banda referente ao modo vibracional da conformação C–S–S–C foi identificada em 541 cm-1, sendo atribuído, também, o estiramento trans-gauche-trans.
Considerando-se que o estiramento C–S pode ocorrer entre 630-790 cm-1
(BULKIN, 1991), à banda em 642 cm-1 foi atribuída a este estiramento. Nesse
sentido, a imobilização da anti-IgGh (Fab2) sobre NP-Au pode ser feita por tal região,
A contribuição do dubleto em 830/850 cm-1, referente à respiração do anel da Tyr, não é tão pronunciada. Assim, observa-se apenas uma banda em 858 cm-1.
Em 1005 cm-1 ocorre uma banda que foi atribuída à Phe (ARÊAS & KAWANO, 1991). Já a banda em 1460 cm-1 corresponde à deformação CH2 do Trp
(ZHANG et al., 2008; KENGNE-MOMO et al., 2012). As bandas em 1127, 1144 e 1156 cm-1 correspondem aos estiramentos de C–C ou C–N alquil (KENGNE-MOMO
et al., 2012). Diferentemente da anti-IgGh (H+L), demonstrou-se que a lavagem
pode ser uma etapa significativa para a visualização de bandas nas regiões de 1000-1100 cm-1.
Assim, na eventual construção de imunossensores, aqueles que permitirem a lavagem das superfícies SERS-ativas e/ou o isolamento das NP-Au com os anticorpos imobilizados da solução matriz, terão os efeitos da contribuição dos tampões suprimidos.
Na literatura, há propostas para a construção de imunossensores que se baseiam exclusivamente no conhecimento do espectro SERS de imunoglobulinas ligadas à nanopartículas. Balzerova e colaboradores produziram um sensor do tipo
label-free para identificar IgGh em sangue de pacientes, utilizando-se
nanocompósitos magnéticos de Ag com anti-IgGh imobilizada (BALZEROVA et al., 2014). Neste caso, os anticorpos utilizados não foram ligados diretamente à Ag, mas foi feita a modificação da superfície com etilamina, sendo a banda Ag–N identificada em 605 cm-1, com posterior ligação dessas moléculas com as anti-IgGh.
Como foi demonstrado neste trabalho, a IgGh ou seu fragmento F(ab)’ pode ser imobilizado diretamente sobre as superfícies de Au, acompanhando-se a banda associada ao modo vibracional de C–S (679 cm-1). Assim, uma etapa na eventual
a etilamina. Porém, como foi proposto, o uso dos fragmentos F(ab)’ seria o mais adequado, tendo-se em vista a possível orientação do paratopo em região oposta à superfície de Au, o que favoreceria a interação Ab-Ag.
Vale destacar que seria relevante a aproximação do paratopo com a superfície onde o campo elétrico, gerado pela oscilação coletiva dos elétrons (plasmon), é maior e isso seria útil à intensificação do sinal SERS. Como consequência, ter-se-ia a possibilidade de se diminuir o limite detecção em um eventual tipo de imunossensor. No entanto, é necessária uma avaliação sobre a manutenção adequada das conformações dos anticorpos para que a interação Ab- Ag seja mantida, pois a região do paratopo não pode ser afetada.
Considerando-se o favorecimento da aproximação das NP, uma abordagem bastante interessante apresentada por Balzerova e colaboradores corresponde ao uso de nanocompósitos magnéticos. Pois, ao permitir a aproximação das NP por meio da ação do campo magnético, o campo elétrico necessário para que ocorra a intensificação Raman pode ser aumentado (BALZEROVA et al., 2014).
Neste trabalho, o favorecimento da aproximação das NP-Au por meio da ação de um campo magnético e sua separação da solução matriz não foi empregado. Na literatura, tal abordagem tem sido utilizada para detectar espécies de interesse clínico como IgGh e anti-peptídeo citrulinado cíclico (diagnóstico de artrite reumatoide) (BALZEROVA, et al., 2014; CHON, H. et al., 2014). Também, em matriz ambiental para detectar, por exemplo, o antibiótico cloranfenicol em amostras de água (YANG et al., 2016). Nesse sentido, observa-se que a separação magnética é uma tendência, pois favorece a aproximação das NP-Au, cujos campos elétricos estão intensificados, mas também têm a capacidade de separar as NP-Au
modificadas da matriz e, consequentemente, concentrando os analitos que interagiram com os anticorpos imobilizados.
Em relação ao conhecimento dos espectros SERS de anticorpos, as bandas (atribuídas às estruturas secundárias) podem ser utilizadas na relação sinal vs concentração. Balzerova e colaboradores utilizaram as intensidades absolutas das bandas 1539 e 1650 cm-1 para a identificação de IgGh e, realizaram a normalização pela banda 605 cm-1 (atribuída a um link de etilamina) a fim de minimizar os erros associados ao sistema (variação na composição, estrutura e instabilidade do sinal Raman). Na abordagem deste estudo, quando se utilizou os fragmentos F(ab)’ não houve a necessidade de se utilizar um link, tal qual a etilamina, pois a banda em 679 cm-1 poderia ser a banda referência para normalização da curva. Em contrapartida, na eventual proposta de construção de um imunossensor com o uso de fragmentos F(ab)’, seria necessário avaliar a manutenção do reconhecimento de seu paratopo pelo epitopo, o que reforçaria a tese de que a imobilização dos fragmentos F(ab)’ ocorreu, de fato, pela região oposta ao paratopo, isto é, pelas regiões ricas em ligações S–S.
Como pode ser observado, o conhecimento dos espectros de biomoléculas imobilizadas sobre superfícies SERS-ativas permite a eventual construção de imunossensores, cujos limites de detecção podem ser menores, de acordo com a criação de hot spots. A seletividade dos anticorpos ou de seus fragmentos é uma vantagem, principalmente, se estiver associada à elevada sensibilidade que a técnica SERS possui.
Outra abordagem para esse tipo de estudo, é a utilização de estruturas com pontas, tais quais os NB-Au que foram apresentados neste trabalho. Pois, ao se utilizar superfícies SERS-ativas, aquelas que apresentarem maior intensificação do
campo elétrico, serão ferramentas vantajosas para a eventual proposta de construção de imunossensores que, além de fornecer uma relação sinal vs concentração, poderá fornecer informações a respeito da conformação dos anticorpos imobilizados e orientações adotadas pelo anticorpo/fragmento que refletirão no processo de interação Ab-Ag, avaliando se a imobilização prejudicou a conformação adequada à ligação dessas espécies.
5 CONCLUSÕES
Este trabalho abordou etapas importantes para uma eventual proposta de imunossensor baseado em superfícies SERS-ativas. As etapas consistiram em avaliar a possibilidade de se trabalhar com anticorpos purificados, determinar as condições ideais para a geração de fragmentos F(ab)’ dos anticorpos IgGh, anti- IgGh (H+ L) e anti-IgGh (Fab2) para permitir uma aproximação do paratopo com a
região da NP-Au onde ocorre o aumento do campo elétrico (útil à intensificação do sinal Raman), adaptar o preparo de NC-Au para gerar NB-Au que são materiais com potencial para a intensificação do campo elétrico e que poderiam diminuir o limite de detecção de um eventual imunossensor, bem como conhecer os principais modos vibracionais de IgGh e de seus fragmentos F(ab)’ a fim de se avaliar de que maneira ocorre a imobilização dessas espécies sobre as superfícies SERS-ativas e como isso afetaria a interação Ab-Ag em uma etapa de construção de imunossensor.
Em relação à primeira abordagem, a etapa de purificação de anticorpos demonstrou que nos processos que envolvem coluna de afinidade (A, G ou A/G) ou separação de imunoglobulinas por meio do pI não permite a total separação de proteínas que estão presentes no soro juntamente com os anticorpos. No entanto, a possibilidade de se construir imunossensores baseados na técnica SERS deve levar em consideração o conhecimento dos espectros obtidos a partir dessas soluções que contém outras proteínas. Também, avaliar se as mesmas poderiam influenciar em interações não específicas entre o antígeno e o imunossensor.
Em relação à fragmentação de imunoglobulinas, demonstrou-se as melhores condições de concentração de protease (papaína) e tempo de incubação para o máximo rendimento na geração de fragmentos F(ab)’, visualizados por meio da técnica SDS-PAGE. Para IgGh a melhor condição foi papaína 0,1 mg mL-1, durante
24 h de incubação, a 37 °C. Enquanto para anti-IgGh (H+L) foi com papaína 0,1 mg mL-1, durante 12 h, a 37 °C. Por fim, para anti-IgGh (Fab
2) foi de 0,1 mg mL-1,
durante 18 h, a 37 °C. Também, demonstrou-se a vantagem e desvantagem do uso de enzima imobilizada e não imobilizada para tal finalidade.
Sobre as NP-Au, apresentou-se a modificação na preparação de NC-Au para obtenção de NB-Au que, do ponto de vista da técnica SERS, podem ser estruturas com maior potencial para a intensificação dos modos vibracionais, sendo que as extremidades deste tipo de nanoestruturas serão um diferencial para diminuir o limite de detecção em propostas para a construção de imunossensores.
No caso da caracterização espectroscópica de biomoléculas, foram apresentados os espectros Raman e SERS com a atribuição dos seus principais modos vibracionais. Neste sentido, destacou-se a tendência na organização dessas moléculas, no processo de imobilização, quando estão em concentrações altas e baixas. A proposta de imobilização dos anticorpos não clivados foi baseada na existência da região de dobradiça, presente em alguns tipos de imunoglobulinas, que permite o distanciamento dos paratopos entre 60 a 180°. Porém, a melhor abordagem para uma eventual proposta de desenvolvimento de imunossensores consistiu em demonstrar o surgimento da banda principal em 679 cm-1 quando os fragmentos de anticorpos foram colocados em contato com as NP-Au. Em termos de eventual construção de imunossensores, uma maior aproximação da região do paratopo dos anticorpos e do epitopo dos antígenos com o campo elétrico local gerado, devido ao plasmon, é uma vantagem para que as interações anticorpo- antígeno sejam avaliadas.
Neste sentido, a eventual proposta de construção de imunossensores baseados na técnica SERS deve avaliar, entre os apresentados neste trabalho,
outros como: avaliação da manutenção da conformação dos anticorpos ou de seus fragmentos sobre as NP-Au para que permita a correta orientação do paratopo e, consequente, iteração anticorpo-antígeno e estratégias de criação de regiões de intensificação do campo elétrico (por exemplo, uso de NP-Au magnéticas com pontas).
Assim, a derivatizacão deste trabalho rumo ao desenvolvimento de imunossensores permitiria a quantificação e caracterização espectroscópica das espécies envolvidas, sendo uma abordagem interessante para estudos futuros, dada a grande possibilidade de modulação nas condições para a geração da intensificação do campo elétrico, a aproximação do paratopo-epitodo do campo elétrico, gerado pelos plasmons, por meio da clivagem dos anticorpos, o conhecimento das bandas de imobilização sem o uso de links e, por fim, a possibilidade de detecção do tipo label-free nos casos em que a interação anticorpo- antígeno gere uma banda característica no espectro SERS.