DoC

Com o objetivo de avaliar a funcionalidade do plasmídeo pValac:Ag85A, as culturas de células transfectadas com o referido plasmídeo foram analisadas quanto a expressão da proteína Ag85A através da técnica de Imunocitoquimica, com posteriores análises em Microscopia Confocal e também por Citometria de Fluxo.

4.7.3.1 Visualização da Proteína Ag85A por Reação de Imunofluorescência para Análise em Microscopia Confocal.

Para a realização da técnica de Imunocitoquímica e posterior análise por Microscopia Confocal, as células CHO foram transfectadas conforme o item 4.7.2. A placa foi montada depositando-se primeiramente uma lamínula no fundo de cada poço, para se obter crescimento celular na superfície da mesma. Após 48 horas da transfecção com o pValac:Ag85A, realizou-se a confecção de lâminas para detecção

81 da proteína Ag85A. Lâminas de células não transfectadas (controle negativo das células), de células transfectadas e tratadas somente com anticorpo secundário (controle negativo do anticorpo secundário) e de células transfectadas com o plasmídeo pValac:gfp (controle positivo), também foram confeccionadas.

.O meio da cultura celular foi retirado dos poços, estes foram lavados duas vezes com 1 mL de PBS 1X (do inglês- Phosphate Buffered Saline) (vide anexo Seção I- Meios e Soluções ao final do manuscrito) e, em seguida, as células foram fixadas com 700 µL de paraformaldeído 4% (vide anexo Seção I- Meios e Soluções ao final do manuscrito), durante 15 minutos sem agitação. Transcorrido esse tempo, as células foram lavadas novamente com 1 mL de PBS. Para permeabilização das células, foram acrescentados 700 µL de Triton X-100 (0,1% em PBS) (vide anexo Seção I- Meios e Soluções ao final do manuscrito) e a mistura foi incubada por 10 minutos. Posteriormente, procedeu-se a incubação com o anticorpo primário monoclonal DT-17 (mouse monoclonal Ag85A, gentilmente doado pela professora K. Huygens do Operational Directorate

Communicable and Infectious Diseases - Bruxelas), na diluição 1:20 em PBS/BSA 1% (

BSA do inglês- Bovine Serum Albumin) vide anexo Seção I- Meios e Soluções ao final do manuscrito). Para cada lamínula, 100 µL do anticorpo primário diluído foram depositados sobre elas e assim, foram incubadas em câmera úmida por duas horas à temperatura ambiente. Decorrido esse tempo, as lamínulas foram lavadas 5 vezes com 1 mL de PBS, com agitação suave durante 3 minutos para cada lavagem. Posteriormente, elas foram incubadas com 100 µL do anticorpo secundário IgG anti- mouse marcado com Alexa-Fluor 488 (Alexa Fluor® 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Invitrogen), na diluição 1:500 em PBS/BSA 1%, em câmera úmida durante uma hora à temperatura ambiente.

Logo após, as lamínulas com as células transfectadas foram tratadas com o anticorpo primário e secundário, como descrito anteriormente (positivo da reação), ou somente com anticorpo secundário (controle negativo do anticorpo secundário). A marcação nuclear foi feita pela incubação com o fluorocromo DAPI (4,6'-diamidino-2- phenilindol – Invitrogen), fluorocomo este, que tem afinidade pelas regiões ricas em A-T do DNA, na concentração final de 2 µg/mL. Após várias lavagens com 1 mL de PBS, as lamínulas foram dispostas sobre lâminas com meio Hydramount (Merck) ou glicerina

82 tamponada (vide anexo Seção I- Meios e Soluções ao final do manuscrito) e seladas para posterior observação microscópica.

As lâminas montadas foram visualizadas em Microscópio de Varredura a Laser Confocal, modelo LSM 510 Meta Zeiss, utilizando-se a objetiva de 40X e também de 63X, com óleo de imersão. Para detecção da fluorescência do Alexa flúor 488, foi utilizado o laser de argônio e o filtro azul, com emissão máxima a 520 nm. Para detecção do DAPI, foi utilizado a epifluorescência do mesmo microscópio, utilizando-se o filtro para DAPI, com emissão na faixa de 461 nm. A co-localização das imagens com dupla marcação foi realizada pela sobreposição das imagens digitais separadas de cada fluorocromo, imagens estas visualizadas e editadas no programa Zeiss LSM

Image Browser.

4.7.3.2 Verificação da Produção da Proteína Ag85A por Reação de Imunofluorescência para Análise por Citometria de Fluxo.

A citometria de fluxo é uma técnica que permite a análise de propriedades físicas e biológicas de populações e sub-populações celulares (Bacal e Faulhaber, 2003). Esta metodologia tem a capacidade de mensurar propriedades de células individuais, através do emprego de radiação laser, fluxo hidrodinâmico, óptica, substâncias fluorescentes e recursos de informática (Bertho, 2007). Quando uma amostra em solução é injetada no citômetro de fluxo, as células são ordenadas de tal forma que uma única célula por vez seja interceptada pelo laser; assim a disperção de luz (scatter) e a emissão de fluorescência por células que foram marcadas com fluorocromos ou que expressam proteínas naturalmente fluorescentes fornecem informações sobre as propriedades destas células (Rahman, 2006). O parâmetro

Forward Scatter (FSC) se relaciona com o tamanho celular e o Side Scatter (SSC), com

a complexidade citoplasmática. A fluorescência emitida pelas células é detectada por fotodetectores de fluorescência (FL-1, o FL-2 e o FL-3, os quais são capazes de detectar diferentes comprimentos de onda emitidos pelos fluorocromos FITC (verde), PE (laranja) e Cy5 (vermelho), respectivamente). Medições da fluorescência emitida pelas células analisadas podem fornecer dados quantitativos e qualitativos sobre a

83 presença de receptores de membrana e mesmo de componentes intracitoplasmáticos ou nucleares (Rahman, 2006). Assim sendo, esta técnica apresenta um grande espectro de aplicações nas áreas médica e biotecnológica, incluindo estudos de subpopulações linfocíticas, análises de expressão gênica, diagnósticos de doenças, análises de ciclo celular e pesquisas que envolvam vacinas de DNA (Bertho, 2007; Badger et al., 2011).

Assim, outra metodologia adotada neste trabalho visando verificar a funcionalidade do plasmídeo pValac:Ag85A, no que concerne à presença da proteína Ag85A nas células eucarióticas transfectadas com o referido plasmídeo, foi a realização de reações de imunofluorescência para posteriores análises através da técnica de citometria de fluxo. Para tanto, células eucarióticas da linhagem CHO foram transfectadas conforme o item 5.7.2. Após 48 horas da transfecção com os plasmídeos pValac:Ag85A e pValac:gfp (controle positivo), as células foram tripsinizadas, com 1 mL de tripsina, e centrifugadas para posterior contagem das mesmas em câmara de Neubauer. A marcação celular foi realizada em placas de cultura de células de 96 poços com fundo em U (Sarsted EEUU). A reação de marcação foi feita com kit FoxP3

Staining Buffer set BD Biosciences®, segundo as recomendações do fabricante. Para

tanto, a cada poço foi adicionado uma suspensão celular ajustada na concentração de 1x106 células por mL. Logo após, a placa foi centrifugada a 182 g, 4_{⁰C, durante 8} minutos. O sobrenadante foi descartado e o sedimento homogeneizado. Após ressuspender o sedimento em 200 µL de tampão de fixação BD, previamente diluído 20 vezes em PBS, a placa foi incubada por 30 minutos, 4⁰C, ao abrigo da luz. Finalizada essa incubação, a placa foi novamente centrifugada nas condições citadas e o sobrenadante foi desprezado. As células foram lavadas com 150 µL de tampão de permeabilização fornecido pelo kit (tampão mantido a 37⁰C) e posteriormente a placa foi novamente centrifugada nas condições já citadas. Mais uma lavagem foi realizada, com 200 µL da solução PBS-Wash, e, posteriormente, uma centrifugação à 182 g por 10 minutos a 4⁰C. Após o descarte do sobrenadante e homogeneizado do sedimento celular, foram adicionados a cada poço 10 µL do anticorpo primário monoclonal DT-17 (mouse monoclonal anti-Ag85A) na diluição 1:20 e a placa foi incubada à temperatura ambiente, durante 30 minutos ao abrigo da luz. Transcorrido esse tempo as células

84 foram lavadas novamente com 200 µL da solução PBS-Wash e centrifugadas à 182 g à 4⁰C, por 10 minutos, procedimento este realizado duas vezes. Ao pellet de células foram acrescentados 10 µL de anticorpo secundário anti-IgG marcado com Alexa flúor 488 (Alexa Fluor® 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Invitrogen) em uma diluição de 1:500, e, novamente, a placa foi incubada por 30 minutos à temperatura ambiente ao abrigo da luz. Após esse tempo, as células foram lavadas e centrifugadas, por duas vezes, nas mesmas condições já citadas. O sobrenadante foi desprezado e o sedimento final foi fixado em 200 µL de paraformaldeido 3% (vide anexo Seção I- Meios e Soluções ao final do manuscrito), e transferido para tubos apropriados de 5 mL para estocagem a 4⁰C ao abrigo da luz até o momento da leitura no citômetro de fluxo. Como controles negativos do ensaio, células não transfectadas e células transfectadas e tratadas somente com anticorpo secundário (controle negativo do anticorpo secundário), foram utilizadas. O controle positivo do experimento consistiu de células transfectadas com o plasmídeo pValac:gfp.