3. Metode/Materiale
5.2 Diskusjon av hovedfunn
5.2.2 Diskusjon av sammenhenger mellom sosioøkonomisk bakgrunn, BMD, livsstilsvariabler og helserelatert livskvalitet
A atividade enzimática de IPC sintase, ausente em mamíferos, representa um alvo importante para o desenvolvimento de drogas contra espécies de fungos patogênicos (Georgopapadakou, 2000) e também contra tripanossomatídeos (Denny e cols., 2004). Um anti-fúngico que vem sendo estudado é a Aureobasidina A (AbA), um antibiótico produzido pela Aureobasidium pullulans, que apresenta forte ação fungicida in vitro contra vários fungos patogênicos como: Candida albicans, Cryptococcus neoformans e algumas espécies de Aspergillus spp (Ikai e cols., 1991; Takesako e cols., 1991, 1993). A AbA é um depsipeptídeo cíclico (1100 Da) que consiste de oito unidades de aminoácidos e um grupamento hidroxila (figura 3A). O alvo molecular da AbA foi identificado como o produto do gene AUR1 em Saccharomyces
cerevisiae, a IPC sintase, a enzima chave da biossíntese de
(glico)inositol fosforilceramidas em fungos. A figura 3B mostra esquematicamente o sítio de ação da AbA na via de biossíntese de esfingolipídeos. A AbA apresenta pouca toxicidade em camundongos, mostrando-se eficaz quando administrada oralmente em camundongos com candidíase (Takesako e cols., 1994). Outros agentes anti-fúngicos que inibem a IPC sintase também vêm sendo descritos como kafrefungina e rustimicina (Mandala e cols., 1997, 1998).
Figura 3. Estrutura e sítio de ação do inibidor de síntese de esfingolipídeos Aureobasidina A
A: Estrutura da AbA (http://www.chem.gunma- u.ac.jp/~kb4/Peptides/AbA/AbA.html)
B: Esquema da via de biossíntese de esfingolipídeos mostrando
o sítio de ação da AbA, modificado de Denny e Smith (2004).
SM: esfingomielina; PC, fosfatidilcolina; DAG, diacilglicerol; PI, fosfatidilinositol; GlcCer, glucosilceramida; IPC, inositol fosforilceramida.
B
serina + palmitoil CoA
(serina palmitoil transferase)
esfinganina ceramida IPC sintase SM sintase esfingomielina Fungos, plantas e kinetoplastídeos Mamíferos, Plasmodium
AbA
serina + palmitoil CoA(serina palmitoil esfinganina ceramida IPC sintase SM sintase Fungos, plantas e kinetoplastídeos Mamíferos, Plasmodium
serina + palmitoil CoA
(serina palmitoil ) esfinganina ceramida IPC sintase SM sintase Fungos, plantas e kinetoplastídeos Mamíferos, Plasmodium
serina + palmitoil CoA
(serina palmitoil esfinganina ceramida IPC sintase SM sintase inositolfosforil ceramida Inositol inositol Fungos, plantas e kinetoplastídeos Mamíferos, Plasmodium glicoesfingolipídeos UDP glucose UDP GlcCer sintase
serina + palmitoil CoA
(serina palmitoil transferase)
esfinganina ceramida IPC sintase SM sintase esfingomielina Fungos, plantas e kinetoplastídeos Mamíferos, Plasmodium
AbA
serina + palmitoil CoA(serina palmitoil esfinganina ceramida IPC sintase SM sintase Fungos, plantas e kinetoplastídeos Mamíferos, Plasmodium
serina + palmitoil CoA
(serina palmitoil ) esfinganina ceramida IPC sintase SM sintase Fungos, plantas e kinetoplastídeos Mamíferos, Plasmodium
serina + palmitoil CoA
(serina palmitoil esfinganina ceramida IPC sintase SM sintase inositolfosforil ceramida Inositol inositol inositolfosforil ceramida Inositol inositol Fungos, plantas e kinetoplastídeos Mamíferos, Plasmodium glicoesfingolipídeos UDP glucose UDP GlcCer sintase
A
Em Trypanosoma cruzi foi observado que a AbA é capaz de inibir a síntese da IPC e glicoinositolfosfolipídeos, além de interferir na diferenciação de tripomastigotas para amastigotas (Salto e cols., 2003). Em Toxoplasma gondii, Sonda e colaboradores (2005) mostraram que a AbA inibiu de maneira drástica a replicação in vitro do protozoário, além de inibir a síntese de esfingolipídeos do parasita, sem no entanto afetar a síntese de lipídeos e a atividade metabólica do hospedeiro vertebrado. Além disso, a AbA foi capaz de inibir a conversão de formas taquizoítas para bradizoítas, causando vacuolização e perda de estruturas intracelulares no parasita.
Uma vez que o IPC é o metabólito esfingolipídico predominante em Leishmania e que vários trabalhos têm mostrado o papel desses esfingolipídeos na diferenciação, tráfego de vesículas, infectividade e sobrevida desses parasitas, torna-se bastante interessante analisar o efeito de AbA sobre as diferentes formas de Leishmania.
8. “Rafts” lipídicos e membranas resistentes ao detergente (DRMs)
A membrana celular é constituída por uma variedade de lipídeos que diferem em suas propriedades físico-químicas, que são responsáveis pela presença de diferentes domínios funcionais na membrana plasmática, constituídos de proteínas e lipídeos, conhecido como "rafts" lipídicos (Simons e Ikonen 1997). Recentemente, vários trabalhos têm mostrado a presença de microdomínios na membrana plasmática em uma variedade de células eucarióticas. Esses microdomínios são considerados altamente dinâmicos, submicroscópicos, que podem agregar-se após empacotamento de seus componentes, principalmente por interação cis entre as cadeias de hidrocarbonetos saturados dos esfingolipídeos.
O primeiro método bioquímico para definir os “rafts” lipídicos está baseado na resistência dos microdomínios à extração com detergentes não-iônicos como o Triton X-100 a 4ºC (Brown e Rose, 1992), resultando na obtenção de frações denominadas de membranas resistentes a detergentes (DRMs,
detergent-resistant membranes). Os DRMs podem ser isolados
como frações de membranas de baixa densidade por homogeneização das células com diferentes tampões de lise (por exemplo, tampão contendo detergente ou soluções hipertônicas) seguidas de ultracentrifugação por gradiente de densidade de sacarose (Iwabuchi e cols., 1998).
Os estudos de DRMs têm mostrado que algumas proteínas estão preferencialmente localizadas nas regiões organizadas dos microdomínios (Rajendran e Simons, 2005). Como exemplo, as proteínas GPI-ancoradas, que estão ligadas à camada externa da membrana via uma âncora de GPI; as proteínas tirosinas quinase da família Src, que estão ancoradas na camada interna da membrana via lipídio; proteínas palmitoiladas e miristoiladas como flotilinas; proteínas ligantes de colesterol como as caveolinas; proteínas G heterodiméricas; e proteínas ligantes de fosfolipídeos como as anexinas. Uma estrutura identificável dos microdomínios é
a cavéola (Kurzchalia e Parton, 1999). A cavéola é uma
invaginação encontrada na membrana plasmática de várias células e é enriquecida em caveolina. A alta expressão de caveolina em células que não apresentam cavéolas como células neuronais e linfócitos, pode induzir a formação de cavéolas (Fra e cols., 1995) e uma perturbação direcionada na caveolina 1 em camundongos causa o desaparecimento da cavéola.
Há evidências de que microdomínios da camada externa e da camada interna da membrana plasmática podem se agregar e exercer papéis importantes nos processos de tráfego de vesículas, sinalização e polarização da membrana (Gri e
cols., 2004; Simons e Toomre, 2000; Harder e Engelhardt, 2004).
Vários trabalhos têm mostrado que bactérias e vírus interagem com microdomíos lipídicos da célula hospedeira (Lafont e cols. 2004; Simons e Ehehalt, 2002). Esses trabalhos sugerem que essa interação seria muito importante no estabelecimento da infecção, na modulação da transdução de sinais e também na formação de poros nas membranas das células do hospedeiro no caso das bactérias.
8.1. DRMs em tripanossomatídeos
Os tripanossomatídeos são organismos altamente polarizados, onde os tráfegos endocíticos e exocíticos são bem direcionados ao bolso flagelar (Overath e cols., 1997). Uma vez que o tráfego de uma grande parte de moléculas GPI- ancoradas é direcionada para essa região, altamente especializada, a organização e a interação das âncoras lipídicas na membrana passou a ser um processo amplamente estudado. Trabalhos recentes têm mostrado que os DRMs estão presentes tanto em Leishmania como em Trypanosoma brucei, sugerindo que esses microdomínios estão amplamente distribuídos em tripanossomatídeos (Nolan e cols., 2000; Denny e cols., 2001; Ralton e cols., 2002; Denny e Smith, 2004). Os DRMs em tripanossomatídeos, como em eucariotos, são definidos como domínios enriquecidos em esfingolipídeos, esteróis e moléculas GPI-ancoradas.
A função de DRMs na patogenicidade de protozoários têm sido estudada no parasita causador da malária, o Plasmodium
falciparum (Haldar e cols., 2002), onde esses microdomínios
teriam papel importante na interação com os eritrócitos do hospedeiro, principalmente na formação da membrana do vacúolo parasitóforo e no tráfego de moléculas GPI-ancoradas tanto da
célula hospedeira quanto do parasita. DRMs também foram descritos na forma sanguínea do Trypanossoma brucei (Nolan e cols., 2000). Os estudos funcionais de DRMs em Leishmania têm sido focalizados na forma promastigota, onde tem-se observado uma disposição diferenciada de moléculas de superfície do parasita, nos microdomínios, durante a diferenciação do parasita procíclico para o metacíclico. Em formas procíclicas, a gp63 está principalmente localizada nos microdomínios resistentes a detergentes não-iônicos, enquanto o LPG permanece na parte mais desorganizada da membrana. Já as formas metacíclicas, essas moléculas e outras como a proteína B hidrofílica e acilada de superfície (HASPB) estão localizadas nos DRMs. A função dessa organização desses componentes ainda não é clara, mas se sugere um papel no estabelecimento da interação do parasita com o inseto vetor e também com o hospedeiro vertebrado, além de possivelmente atuar na transdução de sinal durante esses processos (Denny e cols., 2001; Denny e Smith, 2004).
O papel dos DRMs na infecção por patógenos também vêm sendo analisado do ponto de vista dos midrodomínios da célula hospedeira. Trabalho realizado por Pucadyil e colaboradores (2004) demonstrou que a depleção física de colesterol de macrófagos (pelo tratamento com metil β-ciclodextrina) inibe a ligação e internalização de formas promastigotas de L. (L.)
donovani. O mesmo foi observado utilizando-se a nistatina (um
antibiótico ligante de esteróis) onde o tratamento de macrófagos com esse antibiótico mostrou-se suficiente para inibir a ligação e entrada da L. (L.) donovani ao macrófago (Tewary e cols., 2006).
Dermine e colaboradores (2001) demonstraram que formas intracelulares de L. (L.) donovani residem em fagossomos desprovidos de microdomínios enriquecidos de flotilina (DRMs enriquecidos dessa proteína acumulam-se durante o processo de maturação dos fagossomas) sugerindo que alterações dos
microdomínios dos fagossomos podem representar uma estratégia importante para o estabelecimento e sobrevivência do parasita dentro dos macrófagos. Posteriormente, esses autores (Dermine e cols., 2005) demonstraram que o LPG de formas promastigotas de Leishmania podem inibir a formação de microdomínios dos fagossomos e/ou desorganizar essas estruturas após o processo de fagocitose, reforçando o envolvimento dos microdomínios presentes na membrana dos fagossomos na biogênese do vacúolo parasitóforo. Corroborando esses dados, Chakraborty e colaboradores (2005), utilizando marcadores de "rafts" (toxina B da cólera e CD48) e não "rafts" (CD71), demonstraram que as formas intracelulares de L. (L.) donovani são capazes de desfazer os microdomínios de membrana nos macrófagos infectados, interferindo no processo de apresentação de antígenos e, dessa maneira, evitando a resposta imune da célula hospedeira.
Uma vez que nosso laboratório tem isolado e caracterizado glicoesfingolipídeos em formas amastigotas e também de lipofosfoglicanos e outros glicolipídeos em formas promastigotas de L. (L.) amazonensis, é de extremo interesse analisar a presença desses microdomínios na superfície celular desses parasitas, para a melhor compreensão dos mecanismos de interação com a célula hospedeira na progressão da doença.
OBJETIVOS
Esta tese teve como objetivos:
1) Isolar e caracterizar proteofosfoglicanos de L. (L.)
amazonensis que são secretados ao meio de cultura e presentes
no vacúolo parasitóforo de macrófagos infectados;
2) Analisar o efeito imunomodulatório de diferentes antígenos secretados ou não de formas promastigotas e amastigotas de L.
(L.) amazonensis em culturas de macrófagos peritoneais de
camundongos BALB/c;
3) Caracterizar antígenos glicolipídicos de amastigotas de L.
(L.) amazonensis de culturas axênicas e de isolados de lesão
de animal infectado;
4) Caracterizar a presença de membranas resistentes à ação de detergente (DRMs) a 4ºC em formas amastigotas e promastigotas de L. (L.) amazonensis;
5) Analisar o efeito de inibidor de síntese de esfingolipídeo na viabilidade, na diferenciação e na infectividade de formas amastigotas e promastigotas de L. (L.) amazonensis.
MATERIAIS