No presente trabalho foram elaborados queijos Zamorano DOP com leite pasteurizado de ovelha, na indústria Campostera, na província de Zamora (Espanha). No leite foram incorporadas culturas mesofílicas “O” (1%),
Lactococcus lactis subsp. cremoris e Lactococcus lactis subsp. lactis. Os queijos
foram coagulados a uma temperatura de 32 ºC, acrescentando-se coalho animal (25 ml de coalho líquido ovino de força 1/10000 p/100 litros de leite), de forma que a coagulação fosse verificada em um tempo de 35 a 40 minutos. Após este período a coalhada foi submetida a corte intenso até a obtenção de grão de tamanho semelhante ao de grão de arroz ou de milho, seguido de agitação durante 35 a 40 minutos e aquecimento da massa a uma temperatura de 37-38 oC. Quando os grãos de coalhada adquiriram a consistência desejada, o soro foi eli- minado e a massa transferida para recipientes cilíndricos, que foram submetidos a uma prensagem utilizando prensas pneumáticas durante cinco horas. Posterior- mente, a coalhada foi retirada dos moldes e introduzida na salmoura (20º Baumé e temperatura de 10 ºC), onde permaneceram por 24 horas. Por último, os queijos foram transferidos para as câmaras de maturação, sob diferentes controles de temperatura e com uma umidade relativa de 85%.
As condições de temperatura empregadas na maturação acelerada dos queijos em diferentes controles de temperatura (A, B, C, D e E) e os períodos de coleta das amostras para estudo de um dia (coalhada prensada sem salga) – 7, 15, 30, 60, 120 e 180 dias – estão indicados no esquema da Figura 1.
2.2. Preparo das amostras
As amostras de leite pasteurizado, após 30 minutos de adicionado o fermento, e os queijos do experimento foram obtidos na Indústria Campostera, na província de Zamora (Espanha). As amostras de leite, juntamente com o fer- mento, foram retiradas diretamente da cuba de fabricação do queijo, em
recipiente estéril e sob condições de refrigeração de < 5 oC, transportados até os laboratórios do Departamento de Higiene e Tecnologia de Alimentos (DHTA) da Universidade de León, para realização das análises. As amostras de queijo para as análises seguiram o esquema de coleta apresentado na Figura 1, obedecendo às normas de assepsia preconizadas.
Figura 1 – Diagrama das condições experimentais de maturação do queijo Zamorano DOP. 10 °C 10 °C 15 ºC 15 °C 15 °C 15 °C 10 °C 10 °C 7 dias 15 dias 30 dias 60 dias 120 dias Tempos de coleta de amostras 10 ºC 1 dia 180 dias A 60 dias 120 dias Tempos de maturação com alteração de temperatura 1 dia 180 dias
Controles de temperatura e condições de maturação
Temperatura ambiente
As amostras de leite, bem como as amostras de queijo (retirada a casca e coletadas partes representativas e aleatórias da matriz do queijo), foram obtidas a partir de 50 gramas. A seguir as amostras foram homogeneizadas com 200 ml de uma dissolução estéril de citrato sódico tribásico a 2% a 40-45 oC, em um Stomaccher 400 Lab Blender, durante três minutos, obtendo-se uma diluição de 1/5. A partir desta foram preparadas as diluições decimais sucessivas, mistu- rando-se 10 ml da diluição previamente preparada com 90 ml de água peptonada estéril a 0,1%, seguindo normas preconizadas pela FIL-122 C (1996). Todas as diluições foram preparadas em duplicatas.
2.3. Análises microbiológicas 2.3.1. Leite
As análises microbiológicas realizadas no leite para fabricação do queijo incluíram contagem de mesófilos totais no meio PCA (Plate Count Agar - Oxoid), seguindo metodologia estabelecida pelo APHA (1992), com incubação de 30 oC por 48 horas; contagem de Enterobactireaceae, realizada em VRBGA (Violet Red Bile Glucose Agar - Oxoid), seguindo a metodologia de MOSSEL et al. (1962); e contagem de presumíveis lactococos, feita em ágar M17 (Biokar), seguindo a metodologia proposta por TERZAGHI e SANDINE (1975).
2.3.2. Queijo
As análises microbiológicas dos queijos, em cada etapa do experimento, de acordo com os grupos microbianos, foram as que se seguem:
2.3.2.1. Contagem da flora aeróbia mesófila total
A contagem foi feita em PCA (Plate Count Agar da Oxoid), seguindo metodologia estabelecida pela APHA (1992). As semeaduras foram realizadas em placas de Petri, utilizando 1 ml do inóculo de cada diluição e 15 ml do meio. Posteriormente, as placas foram homogeneizadas e incubadas a 30 ºC/48 horas.
2.3.2.2. Contagem da flora ácido-lática
A contagem de presumíveis lactococos foi feita em ágar M17 (Biokar), seguindo a metodologia de TERZAGHI e SANDINE (1975). Foi semeado em superfície 0,1 ml por diluição em duplicata, incubado a 30 ºC por 18 horas. Este meio é muito rico em componentes nutricionais e promove o crescimento de lactococos. Entre os componentes do meio figuram lactose (5%) e glicerolfosfato de sódio (19%), que permitem aumentar a capacidade-tampão do meio e manter o pH em 7,2±0,1.
A contagem de lactobacilos foi realizada em ágar ROGOSA (Oxoid), conforme metodologia preconizada por ROGOSA et al. (1951). Foi colocado 1 ml de cada diluição nas respectivas placas de Petri e acrescentado o meio, homogeneizado. Após solidificação do meio, foi colocada uma cobertura de ágar para favorecer o crescimento dos lactobacilos (microaerófilos). Este meio foi incubado a 30 ºC por cinco dias.
2.3.2.3. Contagem de Micrococcaceae
A contagem de Micrococcaceae para possíveis micrococos e estafilo- cocos foi utilizado ágar Manitol Sal Agar (MSA- Oxoid), conforme metodologia de CHAPMAN (1945). Utilizou-se 0,1 ml da diluição semeada em superfície, com auxílio de uma alça de Drigalski, e depois incubou-se a 30 oC por 48 horas. Este meio é seletivo para microrganismos halotolerantes, possui manitol e sua utilização se manifesta pela produção de ácido e viragem do meio. A degradação do manitol está relacionada com a patogenicidade do microrganismo e serve como indicativo de S. aureus. As colônias manitol (+), com halo luminoso e crescimento intenso, correspondem em geral a S. aureus. Outras colônias sem cor e pouco crescimento podem corresponder a S. epidermides, entre outros.
2.3.2.4. Contagem de enterococos
A contagem destes microrganismos foi realizada em placas de Petri em meio de KAA (Kanamycin Aesculin Azide Agar Base - Oxoid), seguindo
metodologia de MOSSEL et al. (1978). Foi colocado nas placas, em duplicatas, 1 ml da diluição, o respectivo meio e, após homogeneização e solidificações, incubou-se a 37ºC/24 h. Este meio é suplementado com kanamicina.
2.3.2.5. Contagem de Enterobateriaceas
A contagem destes microrganismos foi realizada em VRBGA (Violet Red Bile Glucose Agar - Oxoid), seguindo a metodologia proposta por MOSSEL et al. (1962). Foi inoculado no meio 1 ml de cada diluição nas respectivas placas de Petri, em duplicata, homogeneizado; após solidificação, colocou-se uma sobrecamada, incubando a 37 oC por 18-24 horas. Este meio possui glicose, açú- car fermentável por todas as enterobactérias, com produção de ácido e vermelho neutro como o indicador do meio. Os sais biliares e o cristal-violeta inibem os outros microrganismos presentes, especialmente as bactérias gram-positivas, pois são seletivos para enterobactérias.
2.3.2.6. Contagem de mofos e leveduras
A contagem de mofos e leveduras foi feita em meio de OGYEA (Oxytetracycline Glucose Yeast Extract Agar - Oxoid), conforme preconizado por MOSSEL et al. (1970). Realizou-se semeadura em profundidade em placas de Petri, por duplicata, colocando-se 1 ml de cada diluição nas respectivas placas, e acrescentado o meio; após homogeneização e solidificação, foram incubadas a 22 oC durante cinco dias.
Depois de transcorrido o tempo necessário para o crescimento de cada grupo microbiano, efetuou-se a contagem das placas que possuíam entre 30 e 300 colônias. Os resultados foram expressos em log de unidades formadoras de colônias por grama (ufc/g).