5. Diskusjon
5.3 Diskusjon av metode
3.5.1- Linhagens MDA-MB-231, DU-145, FGH, V79, MCF-7 e HeLa
Alguns dos compostos obtidos foram avaliados pela capacidade de inibir o crescimento in vitro de células tumorais e não tumorais usando várias linhagens de células derivadas de tecidos normais ou tumores humanos que são: a MDA-MB-231 e MCF-7 (células tumorais de mama), DU-145 (células tumorais de próstata), HeLa (células tumorais de colo de útero), FGH (linhagem celular não tumoral proveniente da boca de humanos, fibroblastos) e a V79 (linhagem celular não tumoral provenientes de pulmão de hamster chinês, fibroblastos). Antes das51
células poderem ser utilizadas, uma série de procedimentos e materiais são necessários e estão descritos a seguir.
Os testes utilizando a linhagem MDA-MB-231 (gentilmente cedida pelo Institut Cochin, CNRS/INSERM, França) foram realizados pela aluna de doutorado do nosso grupo Angélica E. Graminha e pela aluna de mestrado do nosso grupo Melina Mondelli e os testes com as linhagens DU-145 (gentilmente cedida pela profa. Dra Verônica Morandi (UERJ)) e FGH ( adquirida através do Banco de Células do Rio de Janeiro - BCRJ) foram realizados pela aluna de pós doutorado do nosso grupo Juliana Uema Ribeiro, utilizando a estrutura disponibilizada pela Profa Dra. Heloísa S. Selistre de Araújo no Departamento de Ciências Fisiológicas da UFSCar. E os testes de citotoxicidade in vitro contra V79, MCF-7 e HeLa (compradas diretamente do Banco de Células do Rio de Janeiro – BCRJ/UFRJ) foram realizados pela aluna de doutorado do nosso grupo Andréa Prado Carnizello, utilizando a estrutura disponibilizada pela Profa. Dra. Denise Crispim Tavares no Laboratório de Mutagênese e Antimutagênese do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade de Franca (UNIFRAN), Franca-SP.
3.5.1.1- Condições de cultura e incubação com os metalofármacos
As células MDA-MB-231, DU-145, FGH V79, MCF-7 e HeLa, disponíveis, foram mantidas em frascos congelados em nitrogênio líquido (-195 °C). As células foram obtidas (descongeladas a 37 οC por cerca de 90 s) e subculturadas serialmente para posterior uso nos experimentos. As células foram cultivadas como cultura de monocamada aderente em meio DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Médium), suplementado com soro fetal bovino (SFB) 10%. As culturas foram mantidas a 37 oC, em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2.Durante o crescimento das células o meio de cultura foi trocado a cada 2-4 dias para o melhor desenvolvimento das mesmas. A troca do meio de cultura envolve o seguinte procedimento:
→ Troca de meio de cultura
Antes de iniciar o procedimento ligam-se o fluxo e a luz germicida (UV), com pelo menos 30 min de antecedência, colocando dentro tudo que será utilizado:
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descarte, pipetas estéreis, meio de cultura. O fluxo é limpo com álcool etílico 70%; liga a chama e realizar os procedimentos sempre próximos a ela; a garrafa é invertida desprezando o conteúdo (meio de cultura) em um descarte; é adicionado aproximadamente 12-15 mL de meio de cultura com a pipeta estéril; coloca a garrafa em estufa (37 oC / 5% CO2), lembrando sempre de deixar uma meia rosca.
O crescimento das células pode ser acompanhado dia a dia por um microscópio e quando a garrafa contém uma boa quantidade de células (avaliado visualmente pela proximidade entre as células) é necessário o procedimento conhecido por tripsinização para remover as células para usá-las nos experimentos com os complexos. Este procedimento é necessário mesmo se as células não forem utilizadas, uma vez que se a garrafa encher de células as mesmas se soltam do fundo da garrafa e não são mais utilizáveis. A tripsinização envolve o seguinte procedimento: O descarte do meio de cultura e lava com 5 mL de PBS 1x; depois descartar o PBS (Phosphate-buffered saline) e adiciona aproximadamente 5 mL de tripsina à garrafa, deixar de 1-2 minutos na estufa em seguida bate na garrafa (para soltar as células), e adiciona cerca de 5 mL de meio de cultura, centrifuga em tubo Falcon (2000 rpm, 5 min), e descarta o sobrenadante; e por fim ressuspende o pellet em 1 mL de meio de cultura. Se for para fazer contagem de células adiciona 10 mL.
Após a tripsinização, se as células vão ser utilizadas é necessário fazer a contagem das mesmas e ajustar o volume para que cada 200 μL contenha a quantidade desejada de células (em nosso caso 1 x 105 células).
→ Contagem de células e ajuste para o experimento
Após ressuspender as células em 10 mL de meio de cultura, retira 20 μL e mistura com 20 μL do corante azul de tripano. A mistura é transferida para uma câmara de Neubauer, e com a utilização de um microscópio é feita a contagem das células nas duas áreas quadriculadas da câmara. A soma obtida multiplicada por 105 corresponde ao total de células em 10 mL. Nos experimentos deste trabalho foram utilizadas 1 x 105 células por poço, assim deve-se ajustar o volume da solução de células de modo que 200 μL contenham 1 x 105
células.
Após o procedimento de tripsinização, as culturas celulares crescem exponencialmente, onde é feita a contagem e aplicação das células em placa para microcultura de 96 poços (estéril) com densidade de 1 x 105 células por poço (em
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200 μL para MTT e 100 μL para XTT), deve-se armazenar a placa em estufa (37 o C/ 5% CO2) por 24 h para permitir a adesão celular. Após este tempo o meio de cultura é removido (é possível visualizar as células nos poços como manchas esbranquiçadas após a remoção do meio de cultura) utilizando-se a micro-pipeta multi-canal, lava-se cada poço com 200 μL de PBS 1x e adiciona-se 200 μL de meio de cultura DMEM sem soro. Finalmente, os potenciais fármacos nas várias concentrações são adicionados em duplicata, sendo o tempo de exposição de 24 ou 48 hs.
→ Procedimento após tempo de incubação
Foi retirado o meio de cultura com micro-pipeta e adicionou-se 100 μL para método XTT e 200 μL para o método MTT de PBS 1x. Adicionou-se 50 μL de MTT (0,5 mg/mL em H2O Milli-Q) em cada poço para as linhagens MDA-MB-231, DU-145, FGH e adicionou-se 50 µL de solução do kit XTT (ROCHE) para as linhagens V79, MCF-7 e HeLa. Deixou-se 3-4 h em estufa a 37 oCpara as linhagens analisada pelo método MTT e deixou-se 17 hs para as linhagens analisadas pelo método XTT. Adicionou-se 100 μL de isopropanol (somente para as linhagens analisadas pelo método MTT, tomando o cuidado de solubilizar completamente o cristal violeta formado.