a) Campo aberto
O campo aberto foi utilizado para medir a atividade geral dos animais. Trata-se de uma arena circular de madeira medindo 40,0 cm de diâmetro e 40,0 cm de altura pintada na cor cinza grafite. O fundo da arena circular é dividido, virtualmente, por 3 círculos concêntricos em 3 partes iguais: zona central, média e periférica.
A medida de atividade dos animais no campo aberto foi feita por intermédio de um sistema indireto, ETHOVISION (VIDEO TRACKING MOTION & BEHAVIOR
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RECOGNITION SYSTEM® VERSÃO 1.90) descrito abaixo, sempre no mesmo período do dia (entre as 8:00 hs e 14:00 hs), tendo sido avaliada colocando-se cada animal, individualmente, na arena do aparelho (centro da arena) por 5 minutos, tomando-se o cuidado de intercalar os animais dos diferentes grupos para observação, buscando-se assim, minimizar possíveis efeitos decorrentes de variações circadianas na atividade dos animais. Com a finalidade de evitar influência de odores, a arena foi limpa com uma solução aquosa de álcool a 5 % imediatamente antes da introdução de cada animal.
Como indicativos da atividade no campo aberto foram registrados os seguintes parâmetros em cada zona do aparelho:
- Distância percorrida: corresponde à distância gasta pelo animal no ato de entrar sucessivamente com as quatro patas em uma das divisões (zonas) do piso da arena, locomovendo-se (cm).
-Número de movimentos iniciados: corresponde ao número de vezes em que o animal inicia movimentos na arena.
- Tempo em movimento: quanto tempo em segundos, o animal se movimentou no interior das zonas do campo aberto(s).
b) Sistema de observação computadorizada-etho vision
Para as análises comportamentais, foi utilizado o aparelho Ethovision® (Noldus Information Technology®, Wageningen, The Netherlands) que consiste em um sistema de rastreamento em vídeo, análise de movimento e reconhecimento comportamental. O sistema é composto pelo programa Etho Vision Pro-Color 1.9 e pelos itens de “hardware”: câmera filmadora (CCD-Iris color Sony), monitor de vídeo (Sony), computador (Pentium 133, 16 MB de memória RAM, 1,2 gB de disco rígido) com placa de captura de vídeo (TARGA+Truevision, 2D
NTSC), monitor SVGA, teclado e mouse, além de cabos e conectores. A figura 8 mostra este sistema.
Figura 8 - Etho Vision® -(Vídeo Tracking Motion & Behavior Recognition System Versão 1.90)- equipamento de rastreamento em vídeo, usado no procedimento experimental para análise de movimentos
As setas indicam: 1- Campo Aberto para camundongo, 2-Câmera filmadora acoplada ao computador, 3- Monitor de vídeo e 4- Imagem digitalizada representada em pixels
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c) Rastreamento do animal e análise do movimento
A partir de imagens recebidas pela câmera filmadora e digitalizadas na placa de captura, o programa gera coordenadas (x e y) provenientes do centro de gravidade do animal, em intervalos de tempo determinados, obedecendo a uma taxa de amostragem de 6,66 amostras por segundo1. As coordenadas são geradas pelo método de subtração-ideal para rastrear um animal branco em uma arena cinza, no qual o sistema subtrai a imagem de cada amostra dos pontos da imagem de referência (imagem do campo aberto, vazio, isto é sem o animal, e captada antes do experimento).
Para que o sistema possa reconhecer em qual zona2do aparelho se encontra o animal, foi necessário fazer uma representação gráfica do campo aberto.
Assim, sobrepondo-se a imagem do campo aberto vazio, no monitor de vídeo, ao canal de edição de imagem do programa, foi possível desenhar o contorno e as subdivisões de cada arena3.
Antes do início dos experimentos foi necessário configurar o limiar de ruído- diferença mínima de intensidade entre o fundo (background) e o animal- a fim de ignorar possíveis ruídos no sinal de vídeo durante o processamento subseqüentes de imagens. Esse ajuste depende da intensidade de iluminação da arena e é feito automaticamente.
A iluminação da sala durante as observações foi do tipo difusa, tendo sido obtida colocando-se uma placa semi-opaca de acrílico branco abaixo da fonte luminosa, a fim de espalhar a luz uniformemente em todas as direções e minimizar o aparecimento de reflexos e sombras. Outro fator importante para eliminar os reflexos foi o contraste perfeito entre a arena e o animal, fato alcançado pintando-se as superfícies do campo aberto de cor cinza grafite.
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A taxa de amostragem ideal de roedores é de 2 a 8 amostras/seg, já que uma configuração de amostragem inferior causaria perda de detalhes, enquanto um valor superior a 8 excederia a dinâmica do roedor, captando movimentos corporais que não indicam deslocamento e, portanto, superestimando a distância movida.
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Zonas são as divisões da arena: exemplo zona central do campo aberto
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Uma vez que a imagem digitalizada é representada em pixels (picture elements-elementos de imagem), para que as coordenadas do animal sejam, fielmente usadas para calcular seu deslocamento real em centímetros, foi necessário usar um procedimento de calibração da arena. A calibração simples usa dois pontos separados por uma distância conhecida em centímetros (uma régua, por exemplo). No entanto, por assumir uma relação linear entre as distâncias no mundo real e aquela da imagem digitalizada, esse método negligencia a distorção provocada pela lente da câmera, o que afetaria os valores dos parâmetros de deslocamento (por exemplo, a distância movida). Deste modo, foi usado o método de calibração avançado, no qual, sobre a imagem digitalizada de uma cartolina com pontos desenhados com distâncias entre si conhecidas, digitalizados 35 pontos correspondentes às coordenadas reais em centímetros, de modo tal que o sistema tenha condições de fazer uma representação homogênea das distâncias em toda a arena, isto é, tanto no centro como nas extremidades.
d) Compilação e análise dos dados
Cada sessão de 5 minutos no campo aberto correspondia a uma trilha (track). A análise feita pelo Etho Vision® consistia em processar os dados do conjunto de trilhas de um experimento, isto é, a partir do registro das coordenadas e do que ocorria em cada amostra, o sistema calculava os valores numéricos das características de distribuição escolhidas para cada parâmetro, isto é, freqüência e duração (para parâmetros estáveis) valor total e média (para parâmetros contínuos). Os resultados foram “exportados” na forma de um arquivo “txt” (extensão de arquivo texto) que, ao ser aberto na planilha do programa Microsoft Excel 7.0, continha nas colunas às informações relacionadas ao número da trilha, zona, grupo e características de distribuição de cada parâmetro. Antes da análise estatística, a planilha com esses dados passou por
uma série de etapas de organização e de cálculos de porcentagens de tempo e de número de ocorrências dos parâmetros em cada zona.