DISKUSJON

APC har vist seg å være viktig for en normal funksjon av cytoskjelettet. Den bindes direkte til cytoskjelettet (Munemitsu et al. 1994) og indirekte via EB1 (Su et al. 1995), og bidrar også muligens i reguleringen av bevegelsen til aktin via sin interaksjon med Asef, en rac-specific guanine nucleotide ”exchange factor” (GEF) (Kawasaki et al. 2000).

Cytoskjelettet er involvert i flere funksjoner i cellene, og mikrotubuli er blant annet viktig for fordeling av kromosomene ved celledeling. Celler som er homozygote for mutasjoner i APC viser tydelige forstyrrelse i fordeling av kromosomer, som fører til kromosom ustabilitet (Fodde et al. 2001, Kaplan et al. 2001). Det er imidlertid få mekaniske studier gjort på celler som er heterozygote for APC-mutasjoner. I et eksperiment ble det utført en undersøkelse på

”multiple intestinal neoplasia (Min)” mus, som har en nedarvet heterozygote mutasjon i Apc (Mogensen et al. 2002). Resultatene viste en signifikant reduksjon i antallet mikrotubuli tilstede i forhold til hos kontrollmusene. I samsvar med dette fant også Husøy et al. (2003) at et mutert Apc- allel hos musecellelinjer førte til en endring av funksjonen til mikrotubuli, med redusert polymeriseringshastighet. Forfatterne mener at mutasjon i et Apc-allel er tilstrekkelig for å påvirke funksjonen til mikrotubuli, mens inaktivering av begge villtype- alleler er nødvendig for aktivering av Wnt-signalveien. ”(Min)”-mus utvikler spontant mange adenomer i tarmen, og er regnet som en god modell for å studere FAP (Andreassen et al.

2001)

Tighe et al publiserte i 2004 en artikkel hvor de studerte blant annet proliferasjon, overlevelse og kromosom ustabilitet i celler som var transfektert med mutert APC (Tighe, Johnson, &

Taylor 2004). HEK293 og HCT116 celler ble transfektert med APC med tre ulike mutasjoner, N750, N1309 og N1807, noe som resulterte i heterozygot utrykk av APC med ulik lengde i tillegg til normal APC. Vi har fortsatt studiene på disse heterozygote HEK293-cellene medtrunkert APC som ble laget av Tighe et al.(2004).

Western blott med anti-APC ble utført for å være sikker på at cellene fremdeles utrykker det muterte APC- proteinet. Det er vanskelig å kjøre western på APC på grunn av størrelsen på proteinet, men vi fikk frem de trunkerte N750, N1309 og N1807- fragmentene av APC. Det var enklere å få frem N750- båndene, sammenlignet med N1807 og N1309- båndene. Dette

Diskusjon kan skyldes at N1309 og N1807-proteinene er større enn N750 og dermed vanskeligere å få over på blottet. I tillegg indikerer Tighe, Johnson & Taylor (2004) ved kvantitative analyser at N750 ble uttrykt i mengden tilsvarende 20-49 % av det endogene APC, mens hos de to andre mutantene ble det transfekterte APC bare uttrykt som 10 % av det endogene proteinet (Tighe, Johnson, & Taylor 2004). Vi klarte ikke å detektere villtype APC på western blottene. Dette skyldes at de er enda større og dermed svært vanskeligere å få over på blottet. Det viktigste for oss er imidlertid å påvise de trunkerte APC- proteinene, siden det er disse som er transfekterte og det er effekten av disse vi skal studere.

Westernresultatene viser at Tetra. induserer APC, noe som er forventet siden det transfekterte APC- genet kan induseres av Tetra.. Resultatene viser også at MMS behandling øker

produksjon av det transfekterte APC-proteinet. At MMS induserer APC er også vist tidligere (Kundu et al. 2007b).

Økte DNA- skader som følge av MMS behandling kan føre til induksjon av p53, og p53 er vist å kunne binde til APC-promotoren (Jaiswal & Narayan 2001b). Ut fra våre resultater ser det ut som om N750-cellene har mindre p53 enn kontrollcellene i utgangspunktet. Det virker som om MMS induserer p53 og at p53 induserer APC. Dette kan føre til at en eksponering med alkylerende stoffer fører til produksjon av mer p53 protein som man tror kan resultere i enten økt DNA-reparasjon eller økt apoptose (Shaw et al. 1992).

Tighe, Johnson, & Taylor (2004) viste at celler som uttrykte APC- fragmenter i HCT-116 gikk tidligere i mitose når det var spindel toksiner tilstede, konsistent med en defekt i spindel kontrollpunktet. I tillegg viste de at N-APC celler viste økt overlevelse etterfulgt av forlenget spindel- skade. Når det gjelder overlevelse ser det ut som om HEK293 kontrollcellene er mest følsomme for MMS behandling, mens HEK293 N1309- cellene var de minst følsomme både med og uten Tetra.. Dermed er disse resultatene konsistent med resultatene til Tighe, Johnson,

& Taylor (2004), hvor det også ble målt økt overlevelse hos cellene med trunkert APC.

Vi vet ikke om det er nekrose eller apoptose som er den dominerende celledøden for våre celler og hvordan trunkering av cellene påvirker dette. Siden westernresultatene viste at MMS induserer p53, og p53 trolig er med på å bestemme om cellen skal gå i apoptose eller øke reparasjonen (Shaw et al. 1992), kan det tenke seg at det er en økning i apoptose etter eksponering med MMS.

Diskusjon Båndet til kontrollcellene er tydeligere enn båndet til N750- cellene. Det kan derfor se ut til at kontrollcellene har mer p53 enn N750-cellene i utgangspunktet, og med eksponering av MMS. Dette kan bety at kontrollcellene går mer i apoptose enn N750-cellene. Dette stemmer overens med MTT- dataene, hvor kontrollcellene ser ut til å ha lavere overlevelse enn de trunkerte cellene.

Enkelte metoder for DNA- reparasjon er avhengig av et normalt fungerende mikrotubuli, og fordi heterozygot mutasjon i APC er vist å endre mikrotubuli- funksjonen tror vi at mutasjon i APC også kan redusere DNA- reparasjon.

Tighe et. al. viste at N-APC cellene som overlevde ofte inneholdt di-sentriske kromosomer og de ble deretter aneuploide. Disse observasjonene tyder på at trunkerte APC-mutasjoner ikke bare forstyrrer tumorsupressor- funksjonen, men også har egenskaper som onkogener.

Forfatterne foreslår at inital APC-mutasjoner virker som en ”double whammy”, at de destabiliserer genomenet og deregulerer poliferasjon før tap av det andre allelet.

I våre forsøk har vi blant annet eksponert cellene med MMS og røntgenstråling som begge kan føre til dannelse av dobbeltrådbrudd (Choy & Kron 2002, Hoeijmakers 2001).

Dobbeltrådbrudd repareres hovedsakelig via to mekanismer, nonhomolog end-joining (NHEJ) og homolog rekombinasjon (HR).

DNA dobbeltrådbrudd (DSB) er skader som kan resultere i celledød eller forskjellige genetiske endringer inkludert store og små skala slettinger, tap av hetrozygsitet (LOH), translokering og tap av kromosom (Shrivastav, De Haro, & Nickoloff 2008).

De aller fleste svulstene hos Min-mus har tap av Apc villtype allel enten ved LOH eller ved tap av hele kromosomet (Andreassen et al. 2001). Dette kan type på at heterozygot mutasjon i Apc kan føre til en dominant negative effekt på evnen til HR. HR er avhengig av at

mikrotubuli fungerer normalt, siden mikrotubuli er med på å posisjonere homologe sekvenser av DNA ved HR. Endringer i mikrotubuli som følge av heterozygote mutasjon i APC kan dermed føre til forstyrrelser i HR. Nylig ble det vist at økt DSB stimulerer akkumulering av APC til det skadede kromatinet. Dette tyder på at APC deltar i reparasjon av DSB, og at mutert APC kan svekke denne funksjonen (Kouzmenko et al. 2008).

Diskusjon Selv om man ikke har en god metode for å måle homolog rekombinasjon, valgte vi å prøve å måle DNA-skader og eventuell reparasjon med Kometmetoden.

Siden Kometmetoden ikke var kjørt på de transfekterte HEK293-cellene før, valgte vi å begynne å teste helt grunnleggende ting som høsting av celler. Det viste seg at trypsinering kontra skraping førte til minst bakgrunnskader i DNA. Noe de også har brukt tidligere i Kometmetoden på normale HEK293-celler (Liu et al. 2003). Ved trypsinering varmes cellene opp, noe som fører til økt reparasjon og som dermed kan påvirke forsøkene. Vi synes likevel at det ble såpass mye mindre bakgrunnskader av trypsineringen i forhold til skrapingen at en rask trypsinering ville være det beste. Når det gjelder vasking av cellene etter trypsinering synes vi imidlertid at forskjellen på DNA-skader var såpass små at den ekstra tiden det tar med vasking ikke ville være gunstig med hensyn på at alt skal gå raskt. Dessuten var

konsentrasjonen som ble brukt av trypsin såpass liten at fortynnet i mediet vil den trolig ikke ha noe innvirkning på cellene.

MMS-doseresponskurven (figur 7) indikerer at det er en forskjell på cellene, det ser ut til at N750 har litt flere DNA skader enn de andre cellene. Dette forsøket ble imidlertid bare kjørt en gang og vi kan derfor ikke konkludere noe ut fra dette forsøket.

MMS er en DNA-alkylerende agent som har vist seg å danne dobbeltrådbrudd in vivo i Saccharomyces cerevisiae (Lundin et al. 2005). MMS har blitt brukt som en erstatning for stråling i studier av gjær i årevis på grunn av at mange av de originale strålingssensitive mutantene viste seg også å være sensitive for MMS (Lundin et al. 2005). Det er kjent at MMS induserer søster kromatid utveksling (SCEs) (Kaina 2004). SCEs er gjensidig utveksling av DNA mellom søster kromatider i S-fasen. Man tror at dette er en begivenhet i HR. De strålingslignende egenskapene og egenskapene til SCE induksjon viser imidlertid ikke om MMS fører direkte til brudd i DNA-trådene, eller om bruddene kommer sekundært etter methylskader eller etter at repaparsjonsgaffelen har kollapset.

Det har blitt vist at histon H2AX blir fosforylert (γH2AX) som følge av MMS eksponering (Pascucci et al. 2005). Det virker å være en aksept for at fosforylering av H2AX er en spesifikk markør for dobbeltrådbrudd, men at den ikke identifiserer den eksakte kilden for trådbruddet(Wyatt & Pittman 2006). Det er sett hurtig fosforylering av histone H2AX i s-fasen til (Pol) β null-museembryonic-fibroblastsceller etter eksponering med MMS. I tillegg

Diskusjon ble det sett relokalisering i kjernen av Rad51 proteinet som er essensielt for HR. Disse

funnene støtter opp om en hypotese om at DSB som oppstår etter MMS-eksponering, stammer fra SSB som ikke blir reparert i BER. Disse SSB vil være et substrat for HR

(Pascucci et al. 2005). Det er få beviser for at MMS fører direkte til dobbeltrådbrudd, likevel er det tydelig at mellomprodukter i BER trenger HR proteiner. Dette setter søkelyset på at HR også kan være involvert i annen reparasjon enn reparasjon av DSB (Tercero & Diffley 2001).

På tidskurven i Kometforsøket (figur 8) viser kontrollcellene maksimum DNA-skader etter eksponering for 300µM MMS etter 4-8 timer, mens N750-cellene viser maksimum DNA-skader etter eksponering i åtte timer. Dette indikerer at DNA- skadene dannes raskere hos kontrollcellene, og at de blir raskere fjernet, mens de dannes saktere i N750-cellene og blir saktere reparert. Dette stemmer med vår teori om at mutert APC kan påvirke reparasjonen, og da muligens DSB siden det tar lang tid å reparere disse.

Det kan også tenkes at blokkering SN-og LP-BER aktivitet er en mekanisme her. Tidligere studier har indikert at alkylerende DNA-agenter kan fremme nivået av APC i kreftceller fra tarmen og at det induserte nivået av APC kan blokkere SN-og LP-BER aktivitet og påvirke cellulær respons (Jaiswal & Narayan 2008). Konsekvensen av dette er avhengig av cellulær kontekst og omfanget av DNA-skadene, men kan føre til enten økt alkylerings-indusert karsinogense eller apoptose. Dette kan stemme med at DNA- skadene er høyere hos N750- cellene enn hos kontrollcellene i starten av tidskurven når man kan tenke seg at det foregår mest reparering av enkeltrådbrudd.

I det ene eksperimentet ble Camptothecin (Camp.) brukt. Camp hemmer topoisomerase 1og er ofte brukt for å studere mekanismene og faktorer som er involvert i kontrollpunkt regulering og DNA-reparasjon i respons til DSB (Pommier 2006). Resultatet (figur 9) viser at hos cellene som kun ble eksponert med MMS har kontrollcellene signifikant flere DNA-skader enn N750-cellene både etter inkubasjon i 0 og i 5 timer. Dette stemmer overens med forrige figur (figur 8) og med MTT forsøket hvor også kontrollcellene virket å være mer sensitive ovenfor MMS enn N750- cellene. Etter tilsetting av Camp. kan det derimot se ut til DNA skadene øker i større grad for N750- cellene enn for kontrollcellene, med signifikant større DNA skader for N750- cellene enn kontrollcellene etter tilsetning av 10 µM Camp. og inkubasjon i 5 timer (p=0,000). Dette kan igjen stemme med vår teori om at mutert Apc hemmer reparasjon og at dette forsterkes av Camp.

Diskusjon Ved røntgenstråling (10 Gy) av N750- cellene og kontrollcellene samt eksponering med FPG- enzymet (figur 10) var vi ute etter å undersøke mulige forskjeller i reparasjon. Siden HR- proteiner har vist seg å være viktige for BER ble det valgt å eksponere med FPG-proteinet.

FPG ble brukt for å detekter oksidative DNA base skader som 8-OH guanin og andre

oksidative skadede puriner. I tillegg detekterer FPG- alkylerendes kader med høy sensitivitet i Kometmetoden (Speit et al. 2004). Figur 10 viser at begge celletypene hadde mest DNA-skader når de ikke ble inkubert etter bestråling. Uten innkubering, men med tilsatt FPG- enzym, hadde kontrollcellene en signifikant høyere haleintensitet enn N750-cellene (p=

0,001). Det ble funnet en signifikant forskjell på celletypene både med og uten tilsatt FPG for de bestrålte cellene som ble inkubert i 5 timer. Uten FPG viser figuren at kontrollcellene har signifikant mer DNA-skader enn N750-cellene (p=0,000), mens med tilsatt FPG- enzym er det N750- cellene som har en signifikant høyere haleintensitet enn kontrollcellene (p=0,000).

Dette kan igjen tyde på at N750- cellene er dårligere enn kontrollcellene til å reparere.

Siden enkelttrådbrudd repareres hurtig er det viktig å utføre strålingen på is og holde cellene kalde og minimere tiden det tar før lyseringen (som stopper all reparasjon) i Kometmetoden Den enkleste måten å gjøre dette på er å stråle cellene etter støping i gelen. Cellene sto på is før, under og etter stråling på dette siste forsøket. På de andre forsøkene ble det ikke brukt is.

Cellene burde vært satt på is etter trypsinering og dette kan ha påvirket resultatene noe, men siden dette er likt for alle cellene tror vi ikke at is vil endre en eventuell forskjell mellom celletypene, som vi da hovedsakelig var interessert i å undersøke.

Det viste seg at kanskje ikke Kometmetoden er den ideelle metoden for å måle

dobbelttrådbrudd i DNA eller reparasjon av disse. Dette kan skyldes at Kometmetoden måler flere typer DNA- skader (ikke bare DSB) og reparasjon måles ikke direkte men kun som en nedgang i DNA- skader Det er mulig å prøve de to andre metodene som kan brukes for å måle DNA- skader. En tidlig mikroskop- imunocytokjemisk analyse av det endogene APC i

kjernen har imidlertid vist seg å være kontroversiell og problematisk (Brocardo, Nathke, &

Henderson 2005, Mogensen et al. 2002). Dette ble prøvd på våre celler, men det viste seg å være vannskelig å kvantifisere resultatene. En siste måte å måle DNA skader er ved bruk av histone H2AX. Dette blir også ofte gjort ved immunghistokjemi, noe som også vanskeliggjør kvantitering. Det er mulig at det finnes metoder som kan kvantifisere dette ved hjelp av ELISA. Dette er en mulighet som kan prøves ut senere som et mer direkte mål på HR.

Diskusjon FAP- pasienter utvikler multiple adenomer i tykktamen, mens Apc-adenomer hos Min-mus utvikles hovedsakelig i tynntarmen (Colnot et al. 2004). Grunnen til denne forskjellen mellom mennesker og mus er hittil ukjent og nettopp derfor kan undersøkelser med en

humancellelinje kanskje gi nærmere svar på dette. Den humane cellelinjen som ble brukt i våre forsøk, HEK293 har både villtype og mutert APC-allel og er dermed konsistent med svulster hos FAP- pasienter hvor det ene villtypeallelet er inntakt. Dette er dermed de første cellenelinjene som har villtype APC-allel inntakt sammen med mutert APC-allel. De har imidlertid et muterte APC-allel og to villtypeallel, i forhold til FAP-pasienter som har et villtypeallel og et mutert APC- allel. Hvilke forskjeller dette utgjør vet vi ikke, men vi tror likevel at disse cellene er mer nærliggende FAP-pasienters celler enn for eksempel YAMC- celler. Vi synes derfor det er spennende å fortsette videre undersøkelser på disse cellelinjene.

Diskusjon