A maioria dos microrganismos apresenta um crescimento óptimo com valores de humidade iguais ou superiores a 70%.
De forma a garantir a humidade na estufa e a hidratação dos meios de cultura deve colocar-se no interior da mesma um recipiente com água (bi)destilada estéril.
4.6.2 Temperatura
De modo geral, os microrganismos desenvolvem-se a uma temperatura óptima que varia entre 35ºC e 37ºC. É importante prevenir a ocorrência de grandes oscilações de temperatura.
4.6.3 Atmosfera
A atmosfera de incubação dos meios de cultura depende do microrganismos que queremos identificar. A maioria das bactérias isoladas no laboratório de microbiologia é aeróbia, contudo existem espécies que não toleram o oxigénio, não se desenvolvendo na sua presença-bactérias anaeróbias. Existem ainda espécies, como o Campylobacter spp.
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Que cresce em microaerofilia, isto é, com uma pressão reduzida de O2 e, outras, como a Neisseria spp., que vê o seu crescimento favorecido em meios enriquecidos em CO2- capnofília.
Existem dispositivos geradores de atmosfera disponíveis no mercado e que podem ser colocados em caixas herméticas (GENbox) ou em sacos (GENbag) (Figura 13), consoante o número de placas a incubar.
As saquetas geradoras de atmosfera contêm carvão activado, ascorbato de sódio e outros componentes orgânicos e inorgânicos. Os compostos gasosos obtidos na caixa hermética, oxigénio e dióxido de carbono, são ajustados pelas quantidades de compostos químicos que absorvem o O2 e libertam o CO2, consoante se trate de uma saqueta para anaerobiose, microaerofilia ou capnofilia.
Figura 13 – Caixa hermética e saco com atmosfera modificada.
Adaptado de: Biomérieux catalogue ppm] http://www.biomerieux– diagnostics.com/sites/clinic/files/catalogue– ppm– final_0.pdf em 9 de Novembro de 2015
4.7 TÉCNICAS DE SEMENTEIRA
A inoculação dos meios de cultura pode ser realizada através de vários métodos e requer o uso de ansas (de filamento de níquel ou descartáveis).
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A técnica de execução da sementeira varia consoante o objectivo que se pretende e o tipo de meio utilizado.
O método dos 4 quadrantes consiste no espalhamento do inóculo inicial num quadrante da gelose, para depois esgotar o material ao longo dos restantes três quadrantes através de estrias largas, de forma a obter colónias isoladas. O inóculo inicial pode ser colocado na gelose através de uma zaragatoa ou da própria ansa. Para a contagem semiquantitativa de colónias é utilizado outro método, no qual são utilizadas ansas calibradas para efectuar uma estria ao longo de um raio da gelose, e depois o inóculo é espalhado através de estrias apertadas (perpendiculares à primeira) em toda a superfície da gelose. Segue-se a incubação em estufas próprias, respeitando as condições óptimas de crescimento dos microrganismos de interesse (24,29,32,34,50).
4.7.1 Meios sólidos
Por quadrantes ou em roseta: o método dos 4 quadrantes consiste no espalhamento do inóculo inicial num quadrante da gelose, para depois esgotar o material ao longo dos restantes três quadrantes através de estrias largas, de forma a obter colónias isoladas. O inóculo inicial pode ser colocado na gelose através de uma zaragatoa ou da própria ansa. Exemplos: exsudados vaginais e expectorações. Para a contagem semiquantitativa de colónias: a sementeira é realizada utilizando
uma ansa calibrada. Exemplo: exame bacteriológico da urina utilizando ansa calibrada de 1µl.
4.7.2 Meios líquidos Exemplo: líquido ascítico
Produto sólido: é mergulhado directamente no meio. Exemplo: fragmentos de biópsias.
4.8 MEIOS DE CULTURA
Os meios de cultura podem ser líquidos, sólidos (1,5% de agar) ou semi-sólidos (0,5% de agar). Classificam-se em não selectivos, selectivos e diferenciais (Tabela 1) (32,34,50).
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Tabela 1 – Meios de cultura comerciais utilizados (composição: Anexo A)
Nome Utilização
Gelose Columbia + 5% de sangue de carneiro
(COS) Meio não selectivo para isolamento de bactérias exigentes e detecção de hemólises α e β – hemólise α:coloração esverdeada à volta da colónia – hemólise β:Zona clara à volta da colónia ou por baixo da colónia
Gelose Schaedler + 5% de sangue de carneiro
(SCS) Meio não selectivo para isolamento de bactérias anaeróbias estritas e facultativas Caldo Coração – Cérebro (BHI-T) Meio não selectivo para cultura de bactérias exigentes (mo
aeróbios exigentes)
BAcT/ALERT®FA Meio não selectivo para isolamento e detecção de
microrganismos aeróbios e anaeróbios facultativos BAcT/ALERT®FN Meio não selectivo para isolamento e detecção de
microrganismos anaeróbios
BAcT/ALERT®PF Meio não selectivo para isolamento e detecção de
microrganismos aeróbios e anaeróbios facultativos BAcT/ALERT®MB Meio não selectivo para a cultura e isolamento qualitativos
de Micobactérias em amostras de sangue
Gelose Mac Conckey (MCK) Meio selectivo para isolamento de microrganismos Gram- negativos
Gelose Chocolate PolyVitex VCAT3 (VCA3) Meio selectivo para isolamento de Neisseria gonorrohoeae e Neisseria meningitidis
Gelose Chocolate Haemophilus 2 (HAE2) Meio selectivo para para isolamento de Haemophilus sp Gelose Chapman 2 (MSA2) Meio selectivo e diferencial para o isolamento de
estafilococos Gelose Columbia ANC + 5% de sangue de
carneiro (CNA) Meio selectivo para isolamento de bactérias Gram-positivas Caldo selenito F (selenito F-T) Meio líquido selectivo para enriquecimento de Salmonella
Gelose Hektoen (HEKT) Meio selectivo para o isolamento de Salmonella e Shigella Gelose Campylosel (CAM) Meio selectivo para o isolamento de Campylobacter Gelose Muller Hinton 2 + 5% de sangue carneiro
(MHS) Estudo da sensibilidade aos antibióticos e sulfamidas dos pneumococos e outros estreptococos Caldo Todd Hewitt + Antibióticos (TODD H-T) Caldo de enriquecimento selectivo para o estreptococos do
grupo B
Gelose Granada™ (GRAN) Meio selectivo para o rastreio e a identificação dos estreptococos do grupo B (Streptococcus agalactiae) Gelose CLED™ ® (CLED) Meio cromogéneo diferencial para análise quantitativa de
microrganismos urinários.
Germes lactose (+) originam colónias amarelas-pálidas e amarelas por acidificação do meio.
Os germes não fermentadores originam colónias verdes, azuis ou incolores.
Gelose chromID™ Sabouraud (SBS2) Meio cromogéneo para isolamento selectivo e identificação directa de Candida albicans.
Gelose chromID™ VRE (VRE) Meio cromogéneo para pesquisa rápida e fiável de E. faecium e E. faecalis que apresentam uma resistência adquirida à Vancomicina
Gelose chromID™ MRSA (MRSA) Meio cromogéneo para isolamento selectivo e identificação directa de S. aureus
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4.9 COLHEITA, PROCESSAMENTO E ANÁLISE DE PRODUTOS BIOLÓGICOS