e mantidas em banho-maria a 65 °C por 1 hora. Decorrido o período de lise celular, 210 µL do
tampão P foram adicionados à solução. Em seguida, as amostras foram agitadas e centrifugadas por 30 minutos a 4.000 rpm à temperatura ambiente (centrífuga Rotanta 46R). Posteriormente, 550µL do sobrenadante foram transferidos para uma nova placa de 96 cavidades e as amostras submetidas a uma centrifugação de 15 minutos a 4.000 rpm a temperatura ambiente (centrífuga Rotanta 46R). Após este procedimento, 150µL do sobrenadante foram transferidos para uma nova placa de 96
cavidades do tipo Elisa, evitando-se transferir partes do precipitado. A fim de isolar o DNA da solu- ção, 130µL de isopropanol previamente resfriado a −20 °C foram adicionados a cada amostra, as quais foram então incubadas a −80 °C por 15 min ou a −20 °C por 12 horas, centrifugadas a 4.000 rpm por 45 minutos a 4 °C (centrífuga Rotanta 46R) e lavadas com 200µL de etanol 70%, por duas
vezes. Após cada processo de lavagem, a placa com as amostras foi centrifugada a 4.000 rpm por 20 minutos a 4 °C (centrífuga Rotanta 46R). Finalmente, os precipitados foram secos, ressuspendidos em 40µL de TE (Tris-HCl 10 mM pH 8,0 e EDTA 0,1 mM pH 8,0) contendo 1 µg/mL de RNase
A e incubados por 1 hora a 37 °C. A qualidade e a concentração do DNA foram avaliadas em gel de agarose 0,8% por meio de comparação visual com DNA de qualidade e concentração conhecidas.
O tampão de lavagem compõe-se de 10 mM de Tris-HCl pH 8,8, 3 mM de KCl e 1,25 mM de NaCl, preparado imediatamente antes do uso. Já o tampão D é composto por 25 mM de citrato de sódio pH 7,0, 0,5% (w/v) de sarcosil e 4 M de isotiocianato de guanidina. O tampão P compõe-se de 667 mM de Tris pH 7,5, 833 mM de NaCl e 83 mM de EDTA pH 8,0.
Esse protocolo de extração de DNA foi padronizado durante a execução do presente trabalho.
4.5 Identificação do gene mutado
4.5.1 Obtenção e clonagem dos fragmentos de DNA contendo a região mu-
tada
A estratégia utilizada para a identificação do gene mutado em cada Xac mutante foi a digestão de DNA total com enzimas de restrição, clonagem no plasmídeo pBlueScript II SK (Stratagene), seleção do clone contendo o gene mutado para resistência a canamicina (presente apenas no transpo- son Tn5) e seqüenciamento utilizando oligonucleotídeos iniciadores específicos para o transposon e que direcionam a síntese de DNA saindo para fora das duas extremidades do mesmo, ou seja, em direção ao gene no qual ocorreu a inserção.
Dentre as diversas enzimas de restrição que possuem sítio de restrição único dentro da região de clonagem do plasmídeo pBlueScript II SK (Stratagene), selecionaram-se as enzimas EcoR I, Sac I e Sac II devido a estas enzimas não possuírem sítio de restrição no transposon utilizado na geração dos mutantes. Quando a combinação destas enzimas não possibilitou obter o resultado esperado, utilizou-se uma das enzimas BamH I ou Xho I, que possuem sítio de restrição na extremidade do transposon, combinada com a enzima Sac I.
A reação de clivagem do DNA total consistiu de 12,7µL de água bi-destilada estéril, 2,0µL de
tampão 10x que acompanha a enzima, 2,0µL de BSA 10 mg/µL, 0,15µL (3 U) de cada uma das
enzimas de restrição, e 3,0 µL (∼1,5 µg) de DNA total. A reação de clivagem do DNA do vetor consistiu de 8,0µL de água bi-destilada estéril, 2,5µL do tampão 10x que acompanha a enzima, 2,5
µL de BSA 10 mg/µL, 1,0µL de cada uma das enzimas de restrição e 10,0µL (∼10µg) de DNA
do vetor pBlueScript II SK. Quando nenhuma das enzimas não requeria BSA, esta foi suprimida da reação e o volume foi completado com água bidestilada estéril. Em ambos os casos, as clivagens (DNA genômico e vetor) foram executadas por 12 horas a 37 °C.
Desta maneira, dentre os diversos fragmentos de DNA genômico gerados haverá um fragmento contendo o transposon. As extremidades deste fragmento fazem parte do locus do gene mutado.
A clonagem dos fragmentos no vetor foi realizada em um tubo de microcentrífuga de 500 µL contendo 3,5µL de água bi-destilada estéril, 1,0µL de tampão 10x que acompanha a enzima, 0,5 µL (200 U) de enzima T4 DNA ligase, 2,0 µL (∼150 µg) do produto da clivagem do DNA total
e 3,0µL (∼1,2 µg) do produto da reação de clivagem do vetor. A reação de ligação foi mantida a 16 °C por 12 h. Os plasmídeos resultantes desta ligação foram utilizados para transformar E. coli DH10B.
4.5.2 Transformação de Escherichia coli com o plasmídeo recombinante
Os plasmídeos recombinantes foram transformados em Escherichia coli DH10B eletrocompe- tentes (88) em equipamento BioRad modelo Gene Pulser II. Dez microlitros da reação de ligação foram adicionados a 40µL de células eletrocompetentes e submetidos a um pulso elétrico de 1,8 kV
sobre uma capacitância de 25µF. A freqüência “low range” foi ajustada para 400 e a “high range” foi mantida no infinito.
Logo em seguida, adicionou-se ao tubo 1 mL de meio de cultura SOC (20 g de triptona, 5 g de extrato de levedura, 10 mM de NaCl, 25 mM de KCl, 10 mM de MgCl2, 10 mM de MgSO4,
4.5 Identificação do gene mutado 18
20 mM de glicose) e manteve-se as células sob agitação constante a 200 rpm em shaker a 37 °C por uma hora. Decorridos este período, 200 µL da solução foram semeados em placa de Petri
contendo meio de cultura Luria-Bertani (LB) (10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura, 10 g de NaCl, 15 g de ágar, água destilada suficiente para 1 litro), suplementado com 50 µg/mL de canamicina, 100 mM de IPTG e 40 mg/mL de X-Gal (88). Após 12 h de crescimento a 37 °C, a presença de colônias brancas indicou sucesso no procedimento. Nos casos onde não foi possível obter colônias recombinantes, procedeu-se à clivagem do DNA genômico do mutante específico com outra combinação de enzimas de restrição, repetindo-se o processo.
4.5.3 Extração de DNA plasmidial
Uma colônia recombinante foi transferida para tubo de ensaio contendo 3 mL de meio de cul- tura LB líquido, enriquecido com 50µg/mL de canamicina, e mantido sob agitação constante a 200 rpm a 37 °C, por 12 h. Após o período de multiplicação das células, procedeu-se à extração do DNA plasmidial. A suspensão de células foi centrifugada por 5 min a velocidade máxima (Eppendorff 5415C) e o sobrenadante foi descartado. Duzentos microlitros da solução I (25 mM de Tris-HCl pH 8,0, 10 mM de EDTA, 50 mM de D-glicose) previamente resfriados foram adicionados às amostras, agitados até a completa solubilização das células, sendo que a suspensão obtida foi transferida para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e os mesmos foram mantidos à temperatura ambiente por 5 min. Em seguida, 200µL da solução II (0,2 N de NaOH, 1% de SDS) preparados pouco antes do uso foram adicionados às amostras. A solução foi cuidadosamente misturada por meio da inversão dos tubos algumas vezes e mantida no gelo por 5 min. Decorrido este período, 150µL da solução
III (3 M de acetato de potássio, 2 M de ácido acético) foram acrescentados à solução. Os tubos foram gentilmente invertidos algumas vezes a fim de misturar a solução e mantidos por 5 min no gelo. As amostras foram, em seguida, submetidas a 5 min de centrifugação a velocidade máxima em uma centrífuga Eppendorf modelo 5415C à temperatura ambiente. Quinhentos microlitros do sobrenadante foram transferidos para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e 500 µL de
fenol/clorofórmio 1:1 foram adicionados à solução. Após 2 min de homogeneização, procedeu-se a centrifugação das amostras por 5 min a velocidade máxima em uma centrífuga Eppendorf modelo 5415C a temperatura ambiente. A fase aquosa foi transferida para um novo tubo e procedeu-se a uma extração com 1 volume de clorofórmio. As amostras foram centrifugadas por 5 min a velo- cidade máxima (centrífuga Eppendorf modelo 5415C) à temperatura ambiente e a fase aquosa foi transferida para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. O DNA foi precipitado por meio da adição de 700µL de etanol absoluto (temperatura ambiente) à solução. As amostras foram mistu-
radas e mantidas a temperatura ambiente por 5 min e a seguir centrifugadas à velocidade máxima por 5 minutos (centrífuga Eppendorf modelo 5415C) a temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado e o precipitado de DNA lavado, por duas vezes, com 1 mL de etanol 70%, secado sob vácuo e ressuspendido em 30µL de TE (Tris-HCl 10 mM pH 8,0 e EDTA 0,1 mM pH 8,0) contendo RNase (1µg/mL). As amostras foram mantidas a 37 °C por 1 hora e submetidas à eletroforese em
gel de agarose 0,8% a fim de verificar a qualidade do DNA e estimar a concentração por meio da comparação com amostras de DNA de concentração previamente conhecidas.
4.5.4 Seqüenciamento do gene mutado
O DNA genômico clonado no vetor plasmidial foi submetido a uma reação de seqüencia- mento. Uma vez que o transposon se encontra dentro do gene, seqüenciaram-se as duas extre- midades de DNA que o flanqueiam. As reações de seqüenciamento constaram de 3,0µL de água
bi-destilada estéril, 2,0 µL de tampão de seqüenciamento, 2,0 µL de BigDye v3.1 (Applied Bi-
osystems), 2,0 µL de DNA plasmidial e 1,0 µL do oligonucleotídeo iniciador KAN-2 FP-1 (5′-
ACCTACAACAAAgCTCTCATCAACC-3′) ou do oligonucleotídeo iniciador KAN-2 RP-1 (5′-
gCAATgTAACATCAgAgATTTTgAg-3′). Estes oligonucleotídeos possuem complementaridade
de bases nas extremidades do transposon e direcionam a síntese no sentido externo ao transposon. Desta maneira, as regiões do genoma que flanqueiam o transposon foram seqüenciadas.
Ao término da reação de seqüenciamento, que consistiu de 35 ciclos compostos por uma etapa a 96 °C por 10 s, uma etapa a 52 °C por 5 s e uma etapa de polimerização a 60 °C por 4 min, as amostras foram mantidas a 4 °C até o momento do uso. Em seguida, 80 µL de isopropanol foram adicionados a cada amostra. Após 15 min a temperatura ambiente, as amostras foram centrifugadas a 4.000 rpm, em centrífuga de placas Rotanta 46R (Hettich) cm rotor para microplacas, por 45 min a 20 °C. Após precipitação do DNA, o sobrenadante foi descartado e as amostras foram lavadas, duas vezes, com 200µL de etanol 70% seguido de centrifugação a 4.000 rpm por 15 min a 20 °C, na mesma centrífuga Rotanta 46R. As amostras foram secas a vácuo e submetidas ao seqüencia- mento em um seqüenciador automático ABI 3100 conforme metodologia sugerida pelo fabricante do equipamento (Applied Biosystems).
As seqüências obtidas foram analisadas por bioinformática, a fim de remover possíveis partes do transposon, e alinhadas com o genoma da Xac para identificar o gene mutado. O processo de alinhamento destas seqüências foi realizado por meio do algoritmo BLASTn e BLASTx (89).
4.6 Validação da biblioteca de mutantes por Southern blotting 20
rentes, para cada um dos mutantes, deve ser igual no sentido de indicar a mutação em uma mesma ORF.