O término de ação da acetilcolina em vertebrados se dá pela ação de duas enzimas, a acetilcolinesterase (AChE) e butirilcolinesterase (BuChE). A AChE exibe especificidade pela ACh, enquanto que a BuChE catalisa a hidrólise de uma ampla variedade de ésteres, e em função disto é também chamada de “pseudocolinesterase” (Darvesh et al., 2003). As duas enzimas podem ser distinguidas pela especificidade de substratos e pelo uso de inibidores seletivos, como o BW284C51 e etopropazina para AChE e iso-OMPA e bambuterol para a BuChE (Massoulié et al., 1993).
A AChE e a BuChE tem ampla distribuição tecidual, sendo encontradas em vertebrados em musculatura esquelética, lisa e cardíaca, além de sistema nervoso central e periférico, sangue, intestino e fígado (Chatonnet e Lockridge, 1989).
Tanto a AChE quanto a BuChE existem em diferentes formas moleculares, geradas por splicing alternativo a partir de genes diferentes (Lockridge e Chatonnet, 1989), como representado na figura 5.
Os múltiplos transcritos gerados por splicing alternativo podem produzir vários tipos de subunidades (Massoulié et al., 1993). Em mamíferos, o domínio catalítico da AChE pode ser seguido de três sequências distintas do mRNA, originando subunidades do tipo “R”, “H” e “T” (Massoullié e col., 1998).
Figura 5 - Formas moleculares da AChE em vertebrados. Notar que os tetrâmeros podem estar
ancorados na membrana por uma cauda de colágeno (ColQ) na junção neuromuscular ou associados à PRiMA. Encontram-se representados também os dímeros que estão presentes nos eritrócitos, ancorados por um grupo glicofosfatidilinositol (GPI, em amarelo). A BuChE apresenta as mesmas formas moleculares, exceto pelo dímero-GPI presente nas hemácias (adaptado de Darvesh e col.,2003).
A subunidade gerada pelo mRNA do tipo R (Readtrough), a sequência é mantida, sem splicing, gerando uma forma monomérica solúvel, ainda não totalmente caracterizada in vivo, mas sabe-se que a sua expressão está aumentada no cérebro de camundongos submetidos a situações de estresse (Massoullié e col., 1998). A sequência “H” sofre uma clivagem pós-translacional e adição de uma âncora de glicofosfatidilinositol, podendo originar dímeros capazes de se ancorar à membrana plasmática, podendo ser encontrada em hemácias e certos órgãos em Torpedo, sendo comum em invertebrados (Massoulié et al., 1996 e 1998). A sequência “T” pode dar origem à monômeros (G1) da subunidade catalítica, que podem apresentar-se associados em dímeros (G2) ou tetrâmeros (G4), unidos entre si por pontes dissulfeto. A forma G1 existe somente na forma solúvel, enquanto as formas G2 e G4 podem apresentar-se solúveis ou ligadas à membrana plasmática (Massoulié et al., 1998). Há ainda possibilidade da formação de formas hetero-oligoméricas, chamadas de assimétricas. As formas assimétricas agrupam um (A4), dois (A8) ou três tetrâmeros (A12) unidos a uma cauda de colágeno não catalítica, encontradas na junção neuromuscular de mamíferos (Massoulié et al., 1996; 1998). Embora a forma A12 seja
observada em musculatura lisa da íris e em intestino, no DD está praticamente ausente (Taxi e Rieger, 1986). Um tetrâmero também pode estar ancorado na junção neuromuscular e em sistema nervoso central à proteína PRiMA “Proline-Rich Membrane Anchor” (Perrier et al., 2002; Aldunate e col., 2004). De forma semelhante, a BuChE apresenta as formas moleculares globulares e assimétricas, além de poder estar associada à PRiMA (Darvesh et al., 2003; Kerkut, 1984), sendo que para a BuChE não foi observado dímero com âncora gicolipídica (Massoulié et al., 1993).
A função principal da AChE é finalizar a ação do neurotransmissor ACh e assim, modular a ativação de receptores colinoceptivos nicotínicos e /ou muscarínicos em sinapses centrais e periféricas. O papel biológico da BuChE não está claro, porém acredita-se que tenha função detoxificadora e hidrólise da ACh que escapa da ação da AChE. Sabe-se que a BuChE é responsável por hidrolisar a succinilcolina, fármaco utilizado em cirurgia como relaxante muscular -bloqueador muscular despolarizante (Lockridge e Chatonnet, 1989). Pessoas com homozigose para a mutação do gene da BuChE apresentam uma enzima não-funcional e não são capazes de metabolizar a succinilcolina, sofrendo apnéia prolongada (Darvesh et al., 2003).
Além de esterases, sabe-se que a AChE e a BuChE possuem atividade arilacilamidase, observada na hidrólise da substância P e atividade de peptidase foi observada para a AChE sobre a Substância P, encefalinas e cromograninas (Lockridge e Chatonnet, 1989). O fato de que a AChE e a BuChE são encontadas em regiões que não apresentam inervação colinérgica tem intrigando muitos pesquisadores, e novos papéis para essas enzimas vem sendo pesquisados, como por exemplo a atividade neuromodulatória, função em sinapses dopaminérgicas e glutamatérgicas em sistema nervoso central, neuritogênese, adesão celular e envolvimento da formação da proteína beta-amilóide na doença de Alzheimer (Lockridge e Chatonnet, 1989; Zimmerman e Soreq, 2006; Soreq e Seidman, 2001).
1.4 TEORIA DA OCUPAÇÃO
Os parâmetros farmacológicos que foram analisados no trabalho (descrição em materiais e métodos) são ferramentas utilizadas para caracterização da interação de uma droga com um sistema receptor e o efeito gerado, ou seja, o receptor e os
O estudo da reatividade de um órgão a uma droga e a mensuração e caracterização deste efeito começaram a ser estudadas em 1933, quando A.J. Clark desenvolveu a “teoria da ocupação”, baseada na lei de ação das massas, para explicar a ligação droga-receptor e a manifestação deste equilíbrio através do efeito farmacológico desencadeado. Mais tarde, Ariens (1954) e Stephenson (1955) ampliaram a teoria, introduzindo os conceitos de atividade intrínseca e eficácia (ver materiais e métodos), respectivamente, na qual propuseram que o efeito não está linearmente relacionado à ocupação de receptores e sim com o estímulo produzido pela droga (Ariens, 1960).
Em 1964, Ariens e colaboradores desenvolveram a hipótese de que o complexo droga-receptor desencadearia uma cadeia de eventos e que cada passo dependeria do anterior culminando num efeito final:
A + R [AR] ...>a ... >b ... >c ...>n ... Efeito
A partir de 1967, Jurkiewicz e colaboradores propuseram a Responsividade Relativa (), com a finalidade de expressar numericamente as diferenças nos efeitos máximos produzidos por vários agonistas totais interagindo com diferentes sistemas receptores, ou seja, o quociente mede a capacidade de resposta do receptor em relação à resposta máxima do sistema contrátil. Desta forma, podemos dizer através da mensuração destes parâmetros se um sistema receptor envolvido na resposta a uma droga em um órgão está modificado ou não.
Em um segmento importante de nosso trabalho, avaliamos como os anticolinesterásicos interferem nos processos contráteis envolvidos na resposta aos agonistas estudados pela mensuração dos parâmetros clássicos da farmacologia em órgãos isolados, visando fornecer subsídios para uma melhor compreensão dos efeitos desses compostos sobre a contração da musculatura lisa de DD. Além disso, fizemos estudos histológicos de transientes de Ca2+, atividade enzimática de colinesterases do ducto deferente, do SNC e experimentos para avaliação de comportamento e memória em camundongos, após tratamento com Tacripirinas.
É objetivo geral do presente trabalho comprovar a atividade de novos compostos híbridos, sintetizados para bloquear a atividade da AChE e do CCVD do tipo L, comparando os efeitos à Fisostigmina, um inibidor clássico da AChE, à Tacrina, da qual estes compostos derivam.
Foi utilizado o DD de Rato e de Camundongo como modelo para avaliar tais efeitos pela medida de contratilidade de órgãos isolados, analisando o papel de inibidores de AChE como agentes “perturbadores” de receptores farmacológicos após exposição in vitro e in vivo. Para atender a esses objetivos específicos usamos a metodologia resumida abaixo:
1. O estudo do efeito agudo in vitro sobre a contração de ACh e NA de ducto deferente isolado de ratos ou camundongos, para quantificar possíveis alterações na resposta dos respectivos receptores na presença dos anticolinesterásicos (Jurkiewicz e Jurkiewicz, 1976; Jurkiewicz e Jurkiewicz, 1977).
2. Estudo da atividade dos compostos como bloqueadores de canais de Ca2+ comparados à Nimodipina com curvas concentração-efeito e tempo-efeito para Ca2+ e medida do Ca2+ citoplasmático com o indicador fluorescente FURA-2AM;
3. Determinação da atividade enzimática da AChE na presença dos novos compostos, comparando o efeito com inibidores de potência conhecida – Fisostigmina e Tacrina;
4. Estudar o efeito sobre a contração de ACh e NA in vivo, após tratamento agudo e crônico dos animais via i.p. com posterior estudo do ducto deferente (Jurkiewicz et al., 1991, 1992; Caricati-Neto et al., 2004, Conceição et al., 2005; Miranda et al., 1995);
Visando verificar se as Tacripirinas teriam ação in vivo como fármacos para tratamento de Alzheimer, foi objetivo adicional a avaliação do aprendizado e memória de camundongos C57Bl/6 após tratamento com os novos compostos, comparando aos anticolinesterásico Tacrina.
3.1 ANIMAIS
Para os experimentos de contração de musculatura lisa, fluorometria, estudos histológicos de transientes citosólicos de Ca2+ e atividade enzimática de colinesterases,
foram utilizados ratos Wistar com idade de 3-4 meses e pesando entre 300 -400 gramas. Usamos também camundongos Swiss com idade de 2,5-3 meses, pesando entre 35-50 gramas para experimentos semelhantes exceto fluorometria. Além disso, fizemos estudos de colinesterases em tecido do SNC. Já para experimentos para avaliação de comportamento e memória foram utilizados camundongos C57/Bl6J, de idade de 4,5 a 5 meses, pesando entre 25-35 gramas. Todos os animais foram criados pelo Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais para Biologia e Medicina (CEDEME) e mantidos no biotério do INFAR, em sala sob temperatura de 20-25ºC e umidade controladas, obedecendo a um ciclo claro-escuro de 12 horas, com livre acesso à água e ração, de acordo com os princípios internacionais para a pesquisa biomédica envolvendo animais (International Guides Principles For Biomedical Research Involving Animals, 1985). Todos os procedimentos empregados neste estudoforam aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UNIFESP (CEP 0547/10).
3.2 REAGENTES
Foram utilizados nos experimentos os reagentes cloreto de sódio (NaCl), cloreto de potássio (KCl), cloreto de Cálcio (CaCl2.2H2O), cloreto de magnésio (MgCl2.6H2O),
bicarbonato de sódio (NaHCO3), fosfato dibásico de potássio (NaH2PO4.H2O) e glicose
(C6H12O6) adquiridos do laboratório Merck. DMSO (dimetilsulfóxido) e o cloreto de bário
(BaCl2) foram adquiridos do laboratório Synth (Brasil). A ACh (Acetylcholine),
noradrenalina ((-) – Arterenol HCL), Tacrina (Tacrine HCl), Fisostigmina (physostigmine sulphate), Iso-OMPA (Tetra-Isopropyl-pyrophosphoramide), BW284C51 (1,5-bis(4 - allyldimethyl ammoniumphenyl)-pentan. 3-one dibromide), DTNB (5,5'-Dithio-Bis (2- Nitrobenzoic Acid), ASCh (Acetylthiocholine iodide), BuSCh (butyrylthiocholine iodide), Triton X-100, N-etilmaleimida, benzamidina (benzamidine hidrochloride) e bacitracina (bacitracin zinc salt) foram comprados do laboratório Sigma Chemical Co. (EUA).
O Pluronic F-127 e a sonda fluorescente FURA-2AM foram comprados do laboratório Molecular Probes (Holanda). Os sais empregados para a preparação do líquido nutritivo foram adquiridos da marca Reagen (Quimibrás, RJ), qualidade P.A. O Reagente de Bradfort utilizado para dosagem protéica foi adquirido do Laboratório Biorad S/A.
3.3 LÍQUIDO NUTRITIVO
Foi utilizado o líquido LNV, de composição (mmol/L): 140,0 NaCl; 2,7 KCl; 1,4 CaCl22H2O; 1,0 MgCl2.6H2O; 12,0 NaHCO3; 0,43 NaH2PO4.H2O; 5,5 C6H12O6
(dextrose) em água destilada (Rocha e Silva, 1961), ou LNV (próprio para o ducto deferente e vesícula seminal) de composição: 138,0 NaCl; 5,7 KCl,; 1,8 CaCl22H2O;
15,0 NaHCO3; 0,36 NaH2PO4.H2O; 5,5 C6H12O6 (dextrose) em água destilada (Picarelli
et al, 1962; Jurkiewicz e Jurkiewicz, 1976). A solução nutritiva era preparada imediatamente antes dos experimentos e tinha o pH ajustado para 7,4.
3.4 APARELHAGEM
A aparelhagem utilizada classicamente na farmacologia de músculo liso isolado está representada na figura 6. Consiste em uma cuba de vidro, no interior da qual está localizada a câmara muscular (CM), com capacidade de 10 mL, sendo conectada a uma serpentina helicoidal (S) por onde se desloca o líquido nutritivo. Esta serpentina helicoidal permanece banhada com água aquecida a 37°C, que circula impulsionada por uma bomba de circulação desde um banho-maria equipado com termostato. O líquido nutritivo contido em um frasco de Mariotte alcança a câmara muscular através de um tubo de borracha de silicone e da serpentina helicoidal que propicia o seu aquecimento a temperatura desejada. Dentro da CM permanece um tubo de vidro dobrado em “L, conectado a uma bomba de aquário ou balão de carbogênio, servindo para aerar o líquido nutritivo e fixar uma das extremidades da preparação. A outra extremidade é amarrada, com uma linha de algodão, a um transdutor de força FT202 (CB Sciences–EUA), que é acoplado a um amplificador ETH 400 (CB Sciences–EUA)
Austrália) para registro das contrações isométricas. O software utilizado para conversão dos dados analógicos em digitais é o Chart for Windows versão 5.0 (AD Instruments - Austrália). Quando se desejava obter registros com estimulação elétrica, o órgão era amarrado entre dois eletrodos de platina conectado ao estimulador elétrico Grass S88 (Grass EUA).
Figura 6 - Representação esquemática da aparelhagem usada na experimentação farmacológica com
músculo liso isolado. LN= frasco de Mariotte contendo o líquido nutritivo, BA = bomba de ar, BM = banho-maria com termostato, T = termômetro, S = serpentina, C = cuba de vidro. O registro das contrações isométricas é captado por um transdutor de força (TF) e visualizado na tela de um computador, no qual aparece a conversão para gramas de um sinal captado em volts pelo conversor analógico digital PowerLab (CAD) após ser amplificado (A). (Da Silva, 1999 - adaptado).