Discussion of results

A informação que se pode retirar dos ensaios de viabilidade sobre os estados fisiológicos das células é limitada a dois níveis extremos de actividade metabólica: o saudável, presente em células viáveis com capacidade para se dividirem, e o correspondente a morte celular (figura 1.7). A vantagem da citometria de fluxo em analisar células individualmente consiste na detecção de uma variedade de estados fisiológicos celulares intermédios que realmente existem numa determinada população, mostrando assim a heterogeneidade da população. A citometria de fluxo permite a avaliação da heterogeneidade de culturas microbianas, à escala da célula individual, não ignorando outras ferramentas importantes tais como a microscopia de varrimento confocal e a análise de imagem (Nebe-von-Caron et al, 1995; Nebe-von-Caron et al, 2000; Porter J. et al, 1996; Rieseberg M. et al, 2001; Silva F. et al, 2010).

Por estes motivos, esta técnica tem tido cada vez mais impacto na comunidade científica. O uso dos vários fluorocromos em citometria de fluxo permite a diferenciação de diferentes subpopulações numa determinada população, correspondentes a diferentes níveis de funcionalidade das células. Esta diferenciação levou a introdução do termo “viável, mas não “culturável”, aplicado a células que não estando metabolicamente activas, também não estão mortas e, evidentemente, não são reveladas através dos ensaios de viabilidade celular. A utilização de critérios do funcionamento celular tais como o potencial da membrana

Figura 1.7: Esquema representativo dos diferentes graus de viabilidade e vitalidade celular

citoplasmática, o estado metabólico e a integridade da mesma, permitem caracterizar estes estados metabólicos (Nebe-von-Caron et al, 2000).

As células de bactérias saudáveis são delimitadas por uma membrana citoplasmática que lhes permite comunicar selectivamente com o ambiente que as rodeia. Os sistemas de transporte activo geram um gradiente electroquímico que é fundamental para o perfeito funcionamento de uma célula saudável. O corante fluorescente brometo de etídio (BE) consegue atravessar uma membrana polarizada, mas só se liga as cadeias do DNA quando a célula não possui um sistema de transporte activo não especifico protão/antiporte. Este sistema quando se encontra activo expulsa este fluorocromo da célula. O iodeto de propídio (PI) também se liga as cadeias do ADN, mas não consegue atravessar uma membrana citoplasmática saudável. Bis-oxonol e um corante liofilizo e aniónico que se acumula intracelularmente desde que a célula se encontre despolarizada. A utilização destes corantes permite a diferenciação dos seguintes estados metabólicos funcionais: células saudáveis (com capacidade para se dividirem), “vitais”, intactas e permeabilizadas. Pensa-se que quando uma célula se encontra sob stresse, alguns dos sistemas de transporte activo são afectados (células “vitais”), seguindo-se a despolarização da membrana citoplasmática (células intactas) e, mais tarde, a sua permeabilização (mortas). Células sem a membrana citoplasmática intacta não conseguem manter ou gerar o gradiente de potencial electroquímico que origina o potencial de membrana. Além disso, a sua estrutura interna, não estando protegida por uma membrana citoplasmática intacta, encontra-se livremente exposta ao meio ambiente, pelo que estas células acabarão por se decompor. Todas estas etapas conduzem à morte celular (Hewitt C.J. et al, 2001; Midgley M., 1987; Nebe-von-Caron et al, 1995).

A citometria de fluxo surge como uma técnica consistente e fiável na detecção das verdadeiras percentagens de células viáveis e mortas, numa determinada população de microrganismos e, por vezes, em situações em que a microbiologia clássica não consegue dar qualquer resposta. A detecção de actividade metabólica, reveladora de crescimento associado à divisão celular é de fácil execução. No entanto, pode haver metabolismo mesmo na ausência de crescimento que produza efeitos indesejáveis tais como a degradação de alimentos, a acumulação de toxinas ou a transferência de genes. Em caso de lesões, dormência (estado fisiológico intermédio entre a morte e o metabolicamente activo) ou privação extrema de nutrientes nas células, a actividade metabólica pode não ser facilmente detectável. Nestas circunstâncias, é possível determinar a integridade da membrana através da retenção ou exclusão de corantes (Silva F. et al, 2010; Silva T.L. et al, 2003).

1.7.1.1 Fluorocromos

O uso de fluorocromos fornece informações adicionais sobre a estrutura da célula ou a funcionalidade. A escolha dos fluorocromos a aplicar na citometria deve ter em conta várias propriedades; o comprimento de onda de absorção máxima e de emissão vai determinar as condições de funcionamento de um determinado fluorocromo. As principais características que um fluorocromo deve ter são: ser biologicamente inerte; ter um coeficiente de extinção e um rendimento quântico elevados, isto é, intensidades de fluorescência elevadas quando associados às células de modo que pequenas concentrações de marcador possam ser detectadas no interior da célula; um espectro de emissão estreito para evitar a sobreposição com outros fluorocromos; fotoestabilidade; baixa toxicidade; e solubilidade em água, entre outros (Diaz M. et al, 2010).

Existe uma vasta gama de Fluorocromos com uma grande diversidade de aplicações e de vários tipos de células. Alguns fluorocromos ligam-se especificamente a moléculas de células ou componentes (ácidos núcleicos, proteínas e lípidos) amplificando a sua fluorescência, outros acumulam selectivamente em compartimentos celulares ou modificam as suas propriedades através de reacções bioquímicas específicas, em resposta a alterações no ambiente, tais como pH, polarização da membrana (cianinas e oxonois) ou actividade enzimática (substratos fluorogénicos) (figura 1.8) (Diaz M. et al, 2010).

A técnica da citometria de fluxo, juntamente com o uso de marcadores fluorescentes, oferece a possibilidade de se efectuar a diferenciação de células muito para além da viabilidade celular, pouco relacionada com a capacidade das células para crescerem e se reproduzirem. Permitindo a

avaliação de propriedades estruturais e/ou funcionais das células, tais como a actividade metabólica, o potencial de membrana e integridade ou a biossíntese de macromoléculas leva a uma profunda caracterização das populações de células. Medições multiparamétricas revelam a presença de estados fisiológicos intermédios entre a vida e a morte celular, mostrando a heterogeneidade inerente às populações microbianas (Diaz M. et al, 2010).

Capítulo 2

Objectivos

Considerando que, existe a necessidade de se encontrar processos de funcionalização antimicrobiana com efeito permanente, eficaz, não tóxico e ecológico, sobretudo para fibras naturais como o algodão, face à sua vasta aplicação em têxteis hospitalares e de aplicação biomédica;

Os principais objectivos deste trabalho consistem no desenvolvimento de materiais têxteis à base de algodão com propriedades antimicrobianas obtidas por processos biotecnológicos que utilizam L-Cisteína, e no estudo e análise do mecanismo de acção que se desencadeia entre a L-Cisteína e as bactérias, como resposta à capacidade antimicrobiana deste aminoácido.

Capítulo 3