Discussion of biochemical results

Técnicas fiáveis e reprodutíveis para realizar manipulação molecular genética são essenciais para a determinação das funções de genes e proteínas identificados nos mais diversos organismos. A transformação genética é uma ferramenta chave para alcançar este objectivo. No caso dos microrganismos patogénicos como os oomicetas, a transformação fornece ainda um método de seguir o crescimento dos mesmos nos hospedeiros, através da aplicação de genes marcadores, como a proteína fluorescente (GFP, Green Fluorescent

Protein), permitindo ampliar os conhecimentos sobre a biologia destes patogénios.

I.1.2.1. Estratégias de transformação genética

Os vectores normalmente usados na transformação genética de fungos não se mostraram adequados para oomicetas, provavelmente devido a diferenças nas sequências necessárias para activar a transcrição dos genes (Judelson et al., 1992). Assim, novos vectores e protocolos para transformação tiveram de ser desenvolvidos. Os promotores dos genes

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ham342 e hsp702 do oomiceta Bremia lactucae mostraram forte actividade em ensaios de

transformação transiente de P. infestans (Judelson e Michelmore, 1991) e foram subsequentemente incorporados em vectores de transformação usados na obtenção de transformantes estáveis (Judelson et al., 1991). Estes promotores continuam a ser habitualmente usados na expressão de transgenes em Phytophthora spp porque mostraram níveis mais altos de actividade do que certas sequências reguladoras próprias de

Phytophthora, como sejam os promotores de genes de expressão constitutiva, como a actina

(Judelson et al., 1993a).

O protocolo de transformação padrão é baseado na transformação de protoplastos por métodos químicos, mediada por lipossomas e/ou tratamento com CaCl2/polietilenoglicol (PEG), seguida de regeneração e selecção com antibióticos em meio sólido (Judelson et al., 1991; Judelson et al., 1993b). Também foi relatada a transformação de zoósporos por métodos químicos semelhantes (Érsek et al., 1994).

Foram observadas altas taxas de co-transformação (até 50%), especialmente se os dois plasmídeos forem linearizados com enzimas de restrição com extremidades compatíveis (Judelson, 1993). Assim, é relativamente rápido clonar um gene de interesse numa cassete de expressão adequada e cotransformar com o plasmídeo de selecção.

Apesar da maioria dos ensaios de transformação se terem centrado em P. infestans (Panabières et al., 1998; Kamoun et al., 1998b; Randall e Judelson, 1999), outros oomicetas foram transformados com o protocolo de transformação induzida quimicamente: P. sojae (Judelson et al., 1993b), P. capsici (Érsek et al., 1994), P. palmivora (Van West et al., 1998, 1999), P. parasitica (Bottin et al., 1999; Gaulin et al., 2002), P. brassicae (Si-Ammour et al., 2003) e Saprolegnia monoica (Mort-Bontemps e Fevre, 1997). Recentemente, também foi descrita a transformação de P. cinnamomi por métodos químicos (McCarren, 2006).

Outras técnicas de transformação foram usadas em Phytophthora spp, fazendo uso do bombardeamento com micropartículas aceleradas sobre micélio, esporângios ou zoósporos (Bailey et al., 1993; Cvitanich e Judelson, 2003a,b), co-cultivo de zoósporos com

Agrobacterium tumefaciens (Vijn e Govers, 2003) e electroporação de zoósporos

(Latijnhouwers e Govers, 2003; Latijnhouwers et al., 2003; Blanco et al., 2005) e protoplastos (Judelson e Michelmore, 1991). Também foi obtida a transformação de protoplastos de

2 _{Ham34 codifica uma potencial proteína estrutural; HSP70 pertence à familia das denominadas heat shock}

Pythium aphanidermatum por electroporação (Weiland, 2003) e de Pythium ultimum com co-

cultivo de zoósporos e Agrobacterium tumefaciens (Vijn e Govers, 2003).

Diversos genes repórter foram usados na transformação de Phytophthora spp, entre eles o gene codificante para a β-glucuronidase e a GFP. Os transformantes foram, depois, usados no seguimento da progressão da doença in planta, na avaliação de resistência à doença, estudo de promotores e visualização de estruturas durante o desenvolvimento (Judelson et al., 1993a; Judelson, 1997; Kamoun et al., 1998c; West et al., 1998, 1999; Bottin

et al., 1999; Fong e Judelson, 2003; Si-Ammour et al., 2003; Cvitanich e Judelson, 2003a;

McLeod et al., 2004; McCarren, 2006).

Até à data não foram relatados quaisquer eventos de recombinação homóloga e o DNA introduzido é integrado no genoma através de recombinação heteróloga (Judelson et al., 1993a; Kamoun, 2003). Por isso, o silenciamento genético baseado na interrupção de genes não é adequado em Phytophthora, até porque, dada a natureza diplóide destes organismos, seriam necessárias duas disrupções consecutivas para silenciar um dado gene (Judelson et al., 1993a). A abolição da expressão genética foi inicialmente testada na inibição de transgenes, com base numa estratégia de silenciamento genético de expressão de sequências anti-sentido dos genes que se pretendiam silenciar (Judelson et al., 1993a); a observada redução dos níveis de mRNA sentido foi, inicialmente, atribuída à degradação de complexos RNA de cadeia dupla, compostos pela hibridação das sequência sentido e anti-sentido. Contudo, foi também demonstrada a acção de silenciamento de sequências transgénicas sentido, homólogas do gene a silenciar e, até, de sequências desprovidas de sequências promotoras (Kamoun et al., 1998b), o que coloca de lado a hipótese da degradação de complexos de RNA de cadeia dupla. Foi, então, proposto um novo mecanismo para explicar este tipo de inibição da expressão genética (West et al., 1999a). Entretanto, o silenciamento com aplicação de sequências transgénicas anti-sentido ou sentido já permitiu obter estirpes deficientes em determinados produtos de genes nativos (Gaulin et al., 2002; Latijnhouwers e Govers, 2003; Latijnhouwers et al., 2004; Blanco et al., 2005).

Recentemente foi relatada a primeira aplicação de RNA de cadeia dupla na mediação de silenciamento em P. infestans (Whisson et al., 2005), mas as bases deste ensaio de transformação transiente, ainda necessitam de ser clarificadas. Esta técnica, também conhecida como RNAi (RNA de interferência) faz uso de pequenas moléculas de RNA de cadeia dupla para induzir o silenciamento de genes com os quais apresenta homologia.

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I.1.2.2. Mecanismos de silenciamento genético

Já foi aqui mencionado um trabalho onde a adopção de uma estratégia de silenciamento genético levou à obtenção de transformantes de P. infestans em que a produção de INF1 foi abolida (Kamoun et al., 1998b). Convém agora analisar os resultados de uma outra pesquisa que, aprofundando o trabalho anterior, levou à clarificação de alguns aspectos dos mecanismos de silenciamento em P. infestans (West et al., 1999a).

A introdução de construções plasmídicas contendo sequências sentido e anti-sentido do gene inf1 levou à inibição de produção da proteína INF1 em 11% a 20% dos transformantes. Foi demonstrado que as sequências promotoras presentes nos transgenes não são necessárias para a indução do silenciamento, visto que, também foram obtidos transformantes silenciados através da introdução de construções com a sequência sentido do gene inf1 e sem a zona promotora.

A ausência de produção da proteína INF1 deveu-se à falta de produção do mRNA correspondente. Aparentemente, a introdução das construções baseadas no gene inf1 provocaram o silenciamento de ambos os genes (endógeno e transgene). O silenciamento observado foi específico para a sequência do gene inf1, pois o gene inf2b (que pertence a uma classe diferente da família de genes das elicitinas mas partilha 60% de homologia com o gene

inf1 na região ORF) continuou a expressar-se em níveis idênticos nos transformantes e não

transformantes.

Uma vez que, apenas uma parte dos transformantes se mostrou silenciada, a introdução dos transgenes não parece ser ela própria a responsável pelo despoletar do silenciamento observado. Este, também não se deve, nem à interrupção do gene inf1, nem a mutações pontuais, mas sim a uma inibição da sua transcrição e é independente do número de integrações do transgene num dado local do genoma. O fenómeno de hipermetilação do DNA não está envolvido no mecanismo de inibição da transcrição.

O silenciamento permanece em heterocariotas (resultantes da fusão de protoplastos derivados de diferentes estirpes homocariotas) contendo núcleos transgénicos e não transgénicos, o que demonstrou que o silenciamento é dominante e actua em trans para silenciar o gene alvo nos núcleos transformados e não transformados. Além disso, o silenciamento é mantido, de maneira estável, em estirpes homocariotas obtidas a seguir à separação dos núcleos dos heterocariotas silenciados, mesmo na ausência dos transgenes (Figura I.5). Uma vez que não foi possível demonstrar a cariogamia (fusão dos núcleos), não é

provável que o estado silenciado do gene inf1 seja transmitido de um núcleo para outro por interacções DNA-DNA específicas, já que, mesmo durante as divisões mitóticas o envelope nuclear permanece intacto na maior parte dos oomicetas (Heath, 1980).

Face a estas observações, os autores propuseram um novo modelo para explicar o fenómeno de silenciamento em P. infestans, o qual baptizaram de “silenciamento genético internuclear” e em que está envolvido um factor de silenciamento difusível.

O novo modelo de silenciamento apresenta diferenças nos mecanismos relativamente aos fenómenos de quelling (observado em Neurospora crassa) (Cogoni et al., 1996) e MIP (Metilação Induzida Pré-meioticamente, observada em Ascobolus immersus) (Colot et al., 1996) mas é muito similar ao fenómeno de paramutação (Meyer et al., 1993; Hollick et al., 1997). Em resumo, a forte redução da transcrição nas estirpes de P. infestans homocariotas não transgénicas deve ser consequência de fenómenos de paramutação que provocam uma modificação da expressão do gene inf1, herdada geneticamente e resultantes possivelmente de alterações conformacionais da estrutura da cromatina nuclear. Pode-se especular que o factor de silenciamento que actua em trans e se move entre núcleos pode ser uma proteína (Pirrota, 1997, 1998; Sherman e Pillus, 1997), uma molécula de RNA aberrante (Wasseneger et al., 1994; Matzke et al., 1996; Schuurs et al., 1997) ou um complexo formado por RNA e proteína.

Em ensaios por Northern blotting, Latijnhouwers e Govers (2003) observaram que nalguns dos transformantes de P. infestans obtidos por silenciamento do gene pigpb13_{, um} rasto de RNA (conhecido, vulgarmente, como smear) substituiu a banda bem definida que representa o mRNA do gene no isolamento selvagem. Este resultado não se deveu a degradação generalizada do RNA dado que não foi observado em transformantes com o gene

pigpa1 silenciado. Assim, as autoras colocam a hipótese de existir outro mecanismo de

3 _{Pigpa e Pigpb são genes codificantes para subunidades das proteínas denominadas G, envolvidas em vários}

processos de regulação celular.

Figura I.5: Ilustração esquemática da transferência do silenciamento genético internuclear em Phytophthora. A fusão de protoplastos de uma estirpe silenciada com sequências antisentido (núcleos e citoplasma brancos) e um isolamento selvagem (núcleos e citoplasma cinzentos) resulta numa estirpe heterocariota (com núcleos brancos e cinzentos) que exibe silenciamento genético (citoplasma branco). A separação nuclear, através de cultura de zoósporos derivados da estirpe heterocariota, resulta em estirpes silenciadas (citoplasma branco) independentemente da presença do transgene. (Figura adaptada de Kamoun, 2003).

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silenciamento genético em Phytophthora, baseado na degradação específica do mRNA que sofreu silenciamento. O mecanismo proposto por West et al. (1999a) funciona a nível pré- transcricional, ao passo que esta nova via de silenciamento funcionaria a nível pós- transcrição.