6.1.1 Produção de mudas e condução do experimento
O experimento foi conduzido entre outubro e dezembro de 2010. As semeaduras do porta-enxerto ‘Guardião’® (Takii do Brasil) e híbrido Pizzadoro® (Nunhems) para enxertia foram feitas 30 dias antes da enxertia e o híbrido Pizzadoro® pé-franco 15 dias, na Fazenda Experimental São Manuel da FCA/UNESP – Botucatu – SP. Foi utilizado substrato comercial Tropstrato® HT Hortaliças para a semeadura e desenvolvimento das mudas nas bandejas.
O hibrido Guardião® é considerado resistente a Murcha bacteriana (Ralstonia solanacearum); Verticillium (Verticillium dahliae); Fusarium raças 1 e 2 (Fusarium oxysporum f. SP. lycopersici 1 & 2); Fusarium (Fusarium oxysporum f. SP radicis- lycopersici); Vírus do Mosaico do Tomate (ToMV) (Tomato Mosaic Virus, Tm-2a.); Nematóides Meloidogyne arenaria (Ma); Meloidogyne javanica (Mj); Meloidogyne incógnita (Mi) (TAKII, 2013). O ‘Guardião’® é compatível com híbridos que apresentam resistência ao
Tomato Mosaic Virus - estirpe 2. Em épocas de temperaturas mais baixas, a empresa produtora recomenda semear entre 2 a 3 dias antes do cavaleiro (enxerto).
O híbrido Pizzadoro® é um tomate para mercado fresco do tipo Saladete (Italiano) com hábito de crescimento indeterminado. Apresenta elevada resistência a Murcha de verticílio (Va e Vd), Murcha de fusário (Fol:0,1), Pinta bacteriana (Pst), Vírus do Mosaico do Tomate (ToMV) e resistência intermediária aos nematóides (Ma, Mi, Mj) (NUNHEMS, 2013).
As enxertias foram feitas no Departamento de Horticultura da FCA/UNESP-Botucatu – SP, de acordo com Goto et al. (2003), utilizando-se três métodos de enxertia (Contato em bisel, Fenda garfagem, Encostia). Os cortes foram realizados com auxilio de lâminas, acima das folhas cotiledonares do porta-enxerto para os métodos Contato em bisel e Fenda garfagem, e acima da primeira folha definitiva para método da Encostia. No enxerto deixou-se três folhas definitivas.
Os enxertos foram fixados pelo clipe de enxertia recomendado para o tomateiro e tutoradas com um palito de bambu colocado na célula da muda enxertada, passando através do grampo de enxertia para melhor fixar a planta.
Após o processo da enxertia, as mudas enxertadas foram recolocadas em bandejas e juntamente com as mudas pé-franco (testemunha) foram rapidamente acondicionadas em câmara úmida e cobertas por tela de sombreamento de 75% (Figura 1). Houve o cuidado de manter câmara de enxertia com umidade relativa sempre próxima a 100% e temperatura entre 26 e 29ºC, fazendo a troca de ar, ou seja, abertura da câmara duas a três vezes por dia, quando a temperatura estava muito elevada. Foi feito também o molhamento dos jornais que forraram a base da câmara, para suprir a necessidade de água e umidade das plantas.
Para evitar estresse das plantas pertencentes às coletas posteriores foi feita uma câmara úmida de enxertia para cada coleta no experimento 1 (Figura 1).
Figura 1.Câmara úmida de enxertia. UNESP/FCA, Botucatu, SP. Foto: Edvar Silva, 2010.
6.1.2 Delineamento do experimento 1 e avaliação da cicatrização das mudas enxertadas
Foi utilizado delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial 4 x 5. Os 20 tratamentos resultaram das plantas enxertadas através dos métodos Contato em bisel, Fenda garfagem, Encostia e enxerto pé-franco (testemunha) com cinco épocas de coletas das plantas (0, 3, 6, 9 e 12 dias após a enxertia) para análise enzimática. Foram utilizadas quatro plantas por repetição.
Foi avaliada a porcentagem de cicatrização baseado na quantidade total de plantas enxertadas e quantidade de plantas que obtiveram a cicatrização da região de enxertia e que estavam aptas para transplante.
6.1.3 Coletas das plantas para análises bioquímicas dos experimentos 1 e 2
As plantas ao serem coletadas, para análise da atividade enzimática, foram lavadas em água, secas com papel para retirada do excesso de umidade, envoltas em papel alumínio, etiquetadas e congeladas em nitrogênio líquido. Em seguida foram levadas em caixas térmicas para o laboratório de Analises Bioquímicas, pertencente ao Departamento de Química e Bioquímica, do Instituto de Biociências, UNESP, Campus de Botucatu. As amostras foram acondicionadas em freezer -80 oC, para posterior determinação da atividade das enzimas e teor de fenóis totais.
6.1.4 Determinação da atividade enzimática e teor de fenóis totais dos experimentos 1 e 2
As atividades enzimáticas e teor de fenóis foram determinadas entre os anos de 2011 e 2012. Estas determinações foram feitas em espectrofotômetro. No experimento 1, as amostras foram os caules das mudas e no experimento 2, as amostras das plantas enxertadas também foram os caules, porém em três partes nas plantas enxertadas, acima, abaixo e no local da enxertia.
6.1.5 Superóxido dismutase (SOD)
A atividade da SOD (EC 1.15.1.1) (Beauchamp & Fridovich, 1973) foi avaliada pela capacidade da enzima em inibir a fotorredução do azul de nitrotetrazólio (NBT) em um meio de reação composto por metionina 5 mmol L-1, EDTA 0,66 mmol L-1, NBT 33 µmol L-1 e riboflavina 0,00165 mmol L-1, em 3,0 mL de fosfato de potássio 50 mM (pH 7,8). A produção de formazana azul, resultante da fotorredução do NBT foi determinada pela absorção a 560 nm. Uma unidade de SOD foi definida como a quantidade de enzima necessária para a inibição de 50% da fotorredução do NBT. A atividade enzimática foi expressa em U g-1 de proteína.
6.1.6 Catalase (CAT) e polifenoloxidase (PPO)
A atividade da CAT (EC 1.11.1.6) foi determinada por adaptação do método de Kar & Mishra (1976), o ensaio foi composto de 150 μL de amostra, que foi extraída em tampão fosfato de potássio + EDTA + DTT + PVPP 100 mmol L-1 pH 7,5. Utilizou – se 1950 μL de tampão fosfato de potássio 100 mmol L-1 (pH 7,5) como tampão de determinação e 750 μL solução de peróxido de hidrogênio 50 mM como substrato enzimático. As leituras foram feitas a 240 nm. A atividade enzimática foi expressa em μmol H2O2 min-1 mg-1 de proteína.
A atividade da PPO (EC 1.14.18.1) também foi determinada pelo método adaptado de Kar & Mishra (1976), pela mensuração da conversão do catecol em quinona. O substrato utilizado foi composto por catecol 0,1 M em tampão acetato de sódio (pH 5,0). Para a reação, que ocorreu a 30 ºC por 30 minutos foi utilizado 0,3 mL da amostra + 1,85 mL de catecol 0,1 M. As leituras foram feitas após a adição de 0,8 mL de ácido perclórico, a 395 nm. A atividade enzimática foi obtida em µmol catecol oxidado min-1 µg-1 de proteína.
6.1.7 Peroxidase (POD)
A atividade da POD (EC 1.11.1.7) foi estimada pelo método de Lima et al. (1999). O ensaio foi realizado em 5,0 mL de tampão acetato de sódio 0,1 M (pH 5,0). O substrato utilizado foi composto por 0,5 mL de 30% peróxido de hidrogênio em tampão fosfato de potássio 0,2 M (pH 6,7) e 0,5 mL de solução de fenol e aminoantipirina. A reação iniciou-se pela adição do extrato bruto e após cinco minutos, adicionou-se 2 mL de álcool etílico absoluto. A atividade enzimática foi realizada em 505 nm e expressa em µmol H2O2 decomposto min-1 mg-1 de proteína.
6.1.8 Fenilalanina amônia liase (PAL)
A atividade da PAL (EC 4.3.1.5) foi determinada somente no segundo experimento, pois segundo a literatura esta enzima tem grande relação com estresse causado por doenças. Utilizou-se o método adaptado de Peixoto et al., 1999. Foi misturado 200 mg de
amostra com 10 mL de 0,1 M de tampão de borato (pH 8,8) contendo 1,2 mL de β mercaptoetanol, 50g (5%) de polivinilpolipirrolidona (PVPP). Esta mistura foi centrifugado por 20 minutos à 4oC (12.500 x g) e depois filtrado em lã de vidro, gerando o extrato. A reação foi iniciada pela adição 1mL do extrato + 1mL de tampão borato 0,2M (pH 8,8) e 1 mL de fenilalanina após 5 minutos de banho-maria. Na amostra controle, o extrato foi substituído por 1 mL tampão borato 0,1M. A reação foi finalizada pela adição de 0,1mL (100PL) de HCl 6N. A leitura foi feita a 290 nm. Um coeficiente de extinção de 104 mM-1 cm-1 foi utilizada para calcular a atividade de PAL, que foi expressa como μmols min-1 mg-1 de proteína.
6.1.9 Fenóis totais
A análise de fenóis totais foi realizada de acordo com o método espectrofotométrico, usando o reativo de Folin-Ciocalteu (SINGLETON & ROSSI JR., 1965). As amostras do material fresco e moídas foram pesadas e colocadas em tubos de centrífuga, que continham acetona a 50% em água. As amostras foram incubadas em banho de ultra-som durante 20 minutos e depois centrifugada a 6000 × g (Hettich Zentrifugen, Mikro220R), durante 10 minutos. Os sobrenadantes foram re-extraídos e combinados. Foi adicionado o reagente de Folin-Ciocalteau e após 3 minuots a 25ºC, uma solução saturada de Na2CO3 foi adicionada, e a mistura de reação foi incubada durante 1 h. A absorbância foi medida a 760 nm (Pharmacia Biotech, Ultrospec 2000) e os resultados foram expressos em fenóis mg g-1 de massa fresca (MF) em equivalentes de ácido gálico.
6.2 EXPERIMENTO 2: Incidência da murcha bacteriana do tomateiro, trocas