Além de propor a previsão da taxa de cisalhamento por meio de equações matemáticas, o cisalhamento foi avaliado qualitativamente em ambos os modelos de reatores airlift (ACC e ASC) na escala de 5 L, sob duas condições de aeração 2 e 5 vvm, em duplicata. A avaliação foi realizada através da observação de alterações morfológicas da bactéria filamentosa
Streptomyces clavuligerus sob os efeitos da agitação imposta nas condições testadas. O procedimento foi realizado conforme o esquema ilustrado de forma simplificada na Figura 3.3.
Figura 3.3 – Esquema do procedimento utilizado para avaliação qualitativa do cisalhamento de S. clavuligerus em meio líquido.
Fonte: Acervo pessoal do autor.
Antes da sua utilização, o micro-organismo Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 encontrava-se acondicionado em criotubos de 3,5 mL sob a forma de células vegetativas suspensas (5 g.L-1 de massa seca) em solução crioprotetora com concentração de 10% (v/v) de
glicerol na temperatura de -80 ºC. Após a retirada dos criotubos da refrigeração, as células foram reativadas utilizando meio de cultura de reativação com base em Costa & Badino [263] e Rosa et al. [249] (Tabela 3.4), sendo o pH do meio ajustado em 6,8 em pHmetro (modelo QX1500, Qualxtron) e esterilizado em autoclave a 121 ºC por 15 min antes da adição do micro- organismo.
Tabela 3.4 – Meio de cultura utilizado na etapa de reativação de S. clavuligerus [249,263]
Componentes Concentração (g.L-1)
Glicerol 15,0
Peptona bacteriológica 10,0
Extrato de levedura 1,00
Extrato de malte 10,0
Mesa incubadora rotativa
Biorreator
Armazenagem Reativação Produção do inóculo
Inoculação no biorreator Operação do biorreator Amostragem
Tampão 3-(n-morfolino) ácido propanesulfônico (MOPS) 21,0
K2HPO4 0,80
MgSO4.7H2O 0,75
Solução de sais* 1,00 (mL.L-1)
* Solução aquosa com 1,0 g.L-1 de MnCl
2.4H2O, 1,0 g.L-1 de FeSO4.7H2O e 1,0 g.L-1 de ZnSO4.7H2O. Na fase de reativação do micro-organismo, 3,5 mL de células vegetativas suspensas presentes em criotubo foram transferidos para frascos Erlenmeyer de 500 mL contendo 50 mL do meio de reativação (Tabela 3.4) e incubados em mesa incubadora rotativa (modelo 430, Nova Ética) sob agitação de 250 rpm e temperatura de 30 ºC por 24 h.
Para a produção do inóculo foram realizadas duas etapas que consistiram do crescimento e produção do micro-organismo. Em ambas as etapas utilizou-se o meio de cultura descrito por Domingues et al. [264] conforme a Tabela 3.5. De forma análoga à fase de reativação, o pH do meio foi ajustado em 6,8 e esterilizado a 121 ºC por 15 min antes da sua utilização.
Tabela 3.5 – Meio de cultura utilizado nas etapas de crescimento e produção de S. clavuligerus [264]
Componentes Concentração (g.L-1)
Glicerol 15,0
Peptona de soja 15,5
Extrato de levedura 1,00
Extrato de malte 10,0
Tampão 3-(n-morfolino) ácido propanesulfônico (MOPS) 21,0
K2HPO4 0,80
MgSO4.7H2O 0,75
Solução de sais* 1,00 (mL.L-1)
* Solução aquosa com 1,0 g.L-1 de MnCl
2.4H2O, 1,0 g.L-1 de FeSO4.7H2O e 1,0 g.L-1 de ZnSO4.7H2O. Na fase de crescimento, frascos Erlenmeyer de 500 mL contendo 45 mL de meio de cultura (Tabela 3.5) foram inoculados com 5 mL do caldo oriundo da fase de reativação e incubados sob as mesmas condições da fase anterior (250 rpm, 30 ºC, 24 h). Na fase de produção, frascos Erlenmeyer de 500 mL contendo 90 mL do meio de cultura para produção (Tabela 3.5) foram inoculados com 10 mL do caldo originado na fase de crescimento, os quais foram incubados de forma análoga ao caso anterior (250 rpm, 30 ºC, 24 h).
Em todas as etapas realizou-se a pesagem dos componentes em balança analítica (modelo XS204, Mettler Toledo) e de precisão (modelo TE3102S, Sartorius), a homogeneização do meio em agitador magnético (modelo C-MAG HS7, IKA) e a manipulação
do micro-organismo (exceto na inoculação em biorreator) em câmara de fluxo laminar (modelo Bio Seg 12, Veco) visando a redução de contaminações do cultivo e do ambiente.
Concluídas as fases de cultivo em mesa incubadora rotativa, 1 L do caldo proveniente da fase de produção foi inoculado no biorreator, volume equivalente à 20% do volume útil do equipamento (5 L), o qual continha 4 L de solução de 4,0 g.L-1 de carboxi-metil celulose e 0,9%
m/v de NaCl. A concentração celular inserida no biorreator em todos os testes foi, em média, 0,05480,0012 g.L-1, a qual foi determinada por método espectrofotométrico
(espectrofotômetro modelo Ultrospec 2100pro, Amersham Biosciences) em absorbância de 600 nm conforme metodologia e curva de calibração proposta por Costa & Badino [265].
A utilização da solução CMC+NaCl ao invés de um meio de cultura nutritivo foi realizada com o intuito de eliminar ao máximo os efeitos do crescimento microbiano sobre a morfologia, onde 0,9% de NaCl no meio mantém a osmolaridade adequada para a sobrevivência das células durante o período dos testes (3 h) e a carboxi-metil celulose simula o comportamento não-newtoniano de um cultivo convencional, sendo um componente que não é consumido como fonte de carbono por S. clavuligerus conforme constatado em testes preliminares. Neste sentido, pode-se dizer que todas as alterações morfológicas ocorridas durante o período de 3 h em que o micro-organismo esteve presente no biorreator em operação são decorrentes apenas do cisalhamento imposto pelas condições testadas.
Desta forma, a análise qualitativa do cisalhamento gerado nos dois modelos de reatores
airlift sob vazões de ar de 2 e 5 vvm foi realizada pela observação de alterações morfológicas do micro-organismo inserido no biorreator, o qual permaneceu em operação pelo período de 3 h, sendo obtidas amostras do conteúdo do biorreator a cada 1 h, incluindo uma amostra antes do início da operação do equipamento.
Monitoramentos do oxigênio dissolvido no líquido (para garantir a sobrevivência das células) e da reologia do meio (a qual informa indiretamente crescimento ou morte das células) foram realizados durante os experimentos, sendo observado em média, 28,4%12,2 de concentração de oxigênio em relação à água saturada, índice de consistência de 0,2690,04 Pa.sn e índice de escoamento de 0,6030,01.
O acompanhamento da morfologia de S. clavuligerus foi realizado por aquisição de imagens das amostras retiradas do biorreator com câmera digital acoplada a um microscópico ótico (modelo BX50, Olympus). Cada amostra foi parcialmente distribuída em três lâminas, onde em cada tratamento (reator, aeração e tempo de operação) cerca de 40 imagens foram adquiridas sob ampliação de 100 vezes. As imagens foram tratadas no software Image proPlus,
sendo que dentre todas as medidas realizadas pelo software para cada objeto, observou-se que os parâmetros de área micelial (desconsiderando os espaços vazios do objeto) e o perímetro do objeto (considerando todo o preenchimento) foram os mais adequados para a classificação das unidades morfológicas em pellets, clumps, hifas ramificadas e hifas isoladas. O modo como o
software utilizado identifica cada objeto pode ser visualizado na Figura 3.4.
Figura 3.4 – Identificação de cada objeto no software Image proPlus: a) imagem inserida no software; b) imagem processada pelo software.
(a) (b)
Fonte: Acervo pessoal do autor.
Para a classificação das unidades morfológicas realizou-se a análise visual de 3340 objetos, classificando-os de acordo com a descrição de Pamboukian et al. [266], Li et al. [247] e Ghojavand et al. [267], sendo consideradas hifas isoladas aquelas que apresentam apenas 2 pontas, hifas ramificadas aquelas com maior número de pontas mas com filamentos livres na dispersão (não emaranhadas), clumps como filamentos emaranhados e pellets como unidades mais densas com aspecto tridimensional. A Tabela 3.6 apresenta imagens do aspecto visual de cada classe morfológica conforme a literatura [266,267] e no presente estudo.
Tabela 3.6 – Aspecto visual de cada tipo de unidade morfológica utilizado para classificação em Pamboukian et al. [266], Li et al. [247], Ghojavand et al. [267] e no presente estudo.
Hifas
isoladas Hifas ramificadas Clumps Pellets Ref.
[266]
[267]
Neste estudo