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3.9.1 Ensaios de atividade antifúngica

Estes ensaios foram realizados no laboratório de Bioquímica da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul sob supervisão da Professora. Dra. Maria Rita Marques.

Os microrganismos utilizados nos ensaios antifúngicos Cladosporium sphaerospermum (Penzig) foram mantidos no Laboratório de Bioquímica da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, MS, Brasil.

Para o ensaio antifúngico, foram preparadas soluções contendo 100, 50, 25, 10, 5 e 1 mg dos extratos oriundos da Col1 (folhas, caule aéreo, caule submerso e raiz adventícia) da espécie G. elegans. Foram aplicados 10,0 µL de cada solução a cromatoplacas pré-revestidas e eluídas com diferentes solventes: extrato hexânico (hexano:acetona [9:1 v/v]), extrato clorofórmico (hexano:acetona [6,5:2,5 v/v]), extrato metanólico (clorofórmio:metanol [8:2 v/v]) e extrato aquoso (clorofórmio:metanol [7:3 v/v]) como fase móvel. A eluição foi desenvolvida em percurso de 5,0 cm, usando a técnica de ascensão unidimensional, e após o que foram removidos completamente os eluentes através de câmara de secagem. As placas foram pulverizadas com suspensão de esporos de C. sphaerospermum em

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glicose e solução salina e incubada por 72 h no escuro em uma câmara úmida a 25 ºC. Após o tempo de incubação, foi observado o crescimento do fungo sobre a placa. Nos locais onde existiam substâncias fungitóxicas surgiu um halo de inibição. Foi utilizada nistatina (1 µg) como padrão positivo (HOMANS; FUCHS, 1970.

3.9.2 Ensaio de potencial alelopático sobre sementes de Lactuca sativa L.

Estes ensaios foram realizados no laboratório de Bioquímica da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul sob supervisão da Professora. Dra. Maria Rita Marques

Foram realizados ensaios para verificar a ação dos extratos e sal inorgânico oriundos da Col1 (folhas, caule aéreo, caule submerso e raiz adventícia) de G. elegans na germinação de sementes e no crescimento de plântulas de Lactuca sativa L. cv. Grand rapids (Asteraceae).

As variáveis analisadas foram: porcentagem de germinação (LOUBARIAN; VALADARES, 1976), comprimento de hipocótilo, comprimento da raiz primária das plântulas (DOBREMEZ et al., 1995) e índice de velocidade de germinação (IVG) (MAGUIRE, 1962).

As sementes de Lactuca sativa L. cv. Grand rapids (Asteraceae) foram obtidas comercialmente.

Para os bioensaios foram utilizadas placas de Petri (9 cm de diâmetro) previamente esterilizadas em autoclave contendo papel de filtro, sobre os quais foram vertidos 2 mL das soluções-teste dissolvidas nos solventes apropriados, nas concentrações de 5,0; 2,5 e 1,25 mg/mL. As placas foram acondicionadas em capela de exaustão de gases, até evaporação completa do solvente. Em seguida, 25 sementes de L. sativa foram colocadas em cada placa, e posteriormente umedecidas com 4 mL de tampão fosfato de sódio 0,025 M pH 6,0.

Os experimentos foram mantidos em câmara tipo BOD (modelo MA 415/S Marconi) a 20 °C e fotoperíodo de 12 h. Como controle positivo foi utilizado cafeína, substância de comprovada atividade inibitória de germinação de sementes, e como

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controle negativo a solução tampão e o solvente utilizado na dissolução das amostras (DOBREMEZ et al., 1995).

Os resultados foram expressos como percentagem de inibição de germinação.

Todos os testes foram realizados em triplicatas. Foram consideradas germinadas as sementes que apresentaram 2 mm de protrusão de raiz, conforme as Regras de Análise de Sementes (BRASIL, 1999). No último dia de contagem, foram obtidos o comprimento de raízes primárias e dos hipocótilos.

Os resultados dos ensaios foram submetidos à análise de variância pelo teste F, e quando evidenciada diferença significativa entre as médias ao nível de 5% de probabilidade de erro, foi efetuada a complementação da análise através da comparação entre médias pelo teste de Tukey.

3.9.3 Ensaio de citotoxicidade in vitro sobre células tumorais

Estes ensaios foram realizados no Laboratório de Oncologia Experimental da Universidade Federal do Ceará (UFC), sob a supervisão da Professora Cláudia do Ó Pessoa.

Foram realizados ensaios para verificar a ação dos extratos oriundos da Col1 (folhas, caule aéreo, caule submerso e raiz adventícia) de G. elegans sobre a citotoxicidade in vitro contra linhagens de células tumorais. Essa análise faz parte de um screening inicial para determinação do potencial antitumoral.

As linhagens utilizadas, HCT-8 (carcinoma de cólon humano), SF-295 (glioblastoma) e MDA-MB-435 (melanoma) foram cedidas pelo National Cancer Institute (NCI - EUA), tendo sido cultivadas em meio RPMI 1640, suplementados com 10 % de soro fetal bovino e 1 % de antibióticos, mantidas em estufa a 37 qC e atmosfera contendo 5% de CO2.

As células foram plaqueadas na concentração de 0,1 x 106 cél/mL para as linhagens MDA/MB-435 e SF-295 e 0,7 x 105 cél/mL para a linhagem HCT-8. Os extratos foram acrescidos em concentração única de 100 µg/mL diluídos em DMSO puro estéril. As placas foram incubadas por 72 horas em estufa a 5% de CO2 a 37qC.

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Os grupos controle receberam a mesma quantidade de DMSO. Doxorrubicina (0,01- 0,58 mg/mL) foi utilizada como controle positivo.

Ao final do processo, as células foram centrifugadas e o sobrenadante, removido. Em seguida, foram adicionados 150 PL da solução de sal 3-(4,5-dimetil-2- tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de tetrazolium (MTT), e as placas foram incubadas por 3 h. A absorbância foi lida após dissolução do precipitado em 150 PL de DMSO puro em espectrofotômetro de placa a 595nm.

O percentual de letalidade celular foi obtido pela fórmula [100 × (T-T0) / (C- T0)], onde T = teste, T0 = crescimento celular antes da adição dos extratos. Os extratos foram classificados como possuindo nenhuma atividade, baixa atividade (até 50% de inibição de crescimento), atividade moderada (entre 51% e 75% de inibição de crescimento) e alta atividade (mais de 75% de inibição de crescimento) para cada uma das linhagem testadas.

Os experimentos foram analisados segundo a média ± desvio padrão da média (DPM) da inibição do crescimento celular usando o programa GraphPad (Intuitive Software for scince, San Diego, CA). Cada ensaio foi realizado em duplicata.

3.9.4 Ensaio de atividade inseticida, sobre Sitophilus zeamais Mots. (Coleoptera: Curculionidae)

Estes ensaios foram realizados no laboratório de Bioquímica da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul sob supervisão do Professor. Dr. Antonio Pancrácio de Souza.

Foram realizados ensaios para verificar a ação inseticida sobre Sitophilus zeamais Mots. (Coleoptera: Curculionidae), dos extratos da Col1 (folhas, caule aéreo, caule submerso e raiz adventícia) de G. elegans.

Os insetos utilizados nos ensaios foram provenientes de criação mantida em laboratório, em grãos de trigo, utilizando-se frascos de vidro de 300 mL, com o gargalo vedado com tecido filó à temperatura de 25 ± 2,2 °C, umidade relativa de 60 ± 10% e foto-período natural.

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Os grãos de trigo foram pulverizados em capela de fluxo laminar com auxilio de um pulverizador acoplado a um compressor de ar, com os extratos obtidos a partir de 10 g de matéria seca da planta.

Após a secagem por 72 horas a 38 °C, o trigo foi acondicionado em caixas plásticas circulares (6 cm de diâmetro e 2,1 cm de altura), totalizando 10 g de trigo por recipiente. Foram realizados testes testemunha com trigo não tratado.

Em cada recipiente foram liberados 20 adultos não sexados de S. zeamais, com idade entre dez e quinze dias.

As avaliações foram feitas ao primeiro, segundo e quinto dia, pela contagem do número de insetos mortos, que foram descartados.

As parcelas foram organizadas segundo o delineamento experimental inteiramente ao acaso, com dez repetições para cada tratamento. Para efeito de análise os dados foram cumulativos desde o primeiro até o quinto dia.

Os testes foram desconsiderados quando a mortalidade ficou acima de 20% ou os números de pupas chegaram a 10%.

Os resultados dos ensaios foram submetidos à análise de variância pelo teste F, e quando evidenciada diferença significativa entre as médias ao nível de 5% de probabilidade de erro, foi efetuada a complementação da análise através da comparação entre médias pelo teste de Tukey.

3.9.5. Ensaio de atividade inseticida, sobre Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) (Diptera: Culicidae)

Estes ensaios foram realizados no laboratório de Bioquímica da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul sob supervisão do Professor. Dr. Antonio Pancrácio de Souza.

Foram realizados ensaios para verificar a ação inseticida sobre Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) (Diptera: Culicidae) dos extratos da Col1 (folhas, caule aéreo, caule submerso e raiz adventícia) de G. elegans.

Os testes de atividade inseticida foram conduzidos segundo adaptação ao padrão da Organização Mundial da Saúde (OMS) [WHO, 1980]. Para os testes

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foram preparadas as diluições em água destilada na concentração de 10 mg/L. Esta concentração é utilizada em testes de atividade inseticida porque na mesma concentração o inseticida temefós (O,O,O’,O’-tetrametil O,O’-ditio-p-fenileno fosforotionato), mata até 98% das larvas de terceiro e quarto “instar” (CARVALHO et al., 2004).

Preparadas as diluições e controle estas foram divididas em tubos de vidro com capacidade de 30 mL. Em cada tubo (réplica) foram colocadas 20 larvas em terceiro para o quarto estágio. Foram utilizadas oito réplicas para o controle e para as substâncias.

A mortalidade foi verificada após 24 h. Larvas moribundas, incapazes de atingir a superfície da água quando tocadas ou que apresentavam tremores ou rigidez, foram consideradas como mortas. Todas as larvas sobreviventes aos testes foram congeladas e descartadas.

Como forma de garantir a qualidade e veracidade dos testes, foi adotada que eles seriam desconsiderados caso a mortalidade atingisse 20% ou o número de pupas chegasse a 10% no controle.

Os resultados dos ensaios foram submetidos à análise de variância pelo teste F, e quando evidenciada diferença significativa entre as médias ao nível de 5% de probabilidade de erro, foi efetuada a complementação da análise através da comparação entre médias pelo teste de Tukey.

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