O distanciamento genético entre isolamentos foi avaliado através do numero de diferenças nucleotídicas por posição (="nucleotide differences per site") (Nei e Li, 1979).
O calculo deste índice foi feito por meio do algorítmo apresentado por Nei e Miller (1990), recorrendo ao programa RESTSITE aplicado ao conjunto de fragmentos de restrição obtidos, tomados cada qual como caracter unitário. Neste cálculo considerou-se igual probabilidade de substituição das quatro bases, igual probabilidade de substituição em cada uma das três posições de cada codão e que o ganho ou perda da cada local de restrição era devido apenas a uma única substituição. Esta última hipótese determina que os valores obtidos sejam mínimos. Para cada par de isolamentos i,j começou-se por calcular um coeficiente de semelhança, F = 2mij/(mi+mj), em que mij o é numero de fragmentos de restrição (obtidos com todas as enzimas) comuns aos dois isolamentos, e
mi e mj o número de fragmentos total obtido em cada isolamento. Este coeficiente foi então utilizado para calcular um parâmetro G definido por meio de um processo iterativo:
Gn = ( F (3 - 2Gn-1)1/4, usando numa primeira aproximação G
1 = F1/4. Uma vez que o valor de G estivesse estabilizado, era empregue para calcular o número de diferenças nucleotídicas por posição, entre os dois isolamentos: dij = (-2/r) Loge G, sendo r o
número de nucleótidos no local de restrição das enzimas empregues (no caso de r variar a formulação é mais complexa; contudo no presente caso r = 4 para todas as enzimas).
Para calcular as divergências nucleotídicas inter-populacionais entre as populações
X e Y, começou-se por calcular os valores de dij para estimar as médias das diferenças nuceotídicas entre todos os isolamentos dentro de cada população (diversidade nucleotídica), DX e DY, e entre todos de ambas as populações, DXY. A divergência nucleotídica, D, entre as populações era então avaliada a partir de DXY depois de este termo ser corrigido por uma parcela que toma em consideração a variação nucleotídica dentro de cada população: D=DXY-(DX+DY)/2 , (Nei e Li, 1979).
27 93 26 + 3 + + - 28 30 69 - + 42 + + 61 71 55 + 41 + + + 73 57 + + + 58 22 16 59 65 21 75 60 + 4 11 - - 77 24 + - - + + + + - - - + + - + + + + + + - - 35 + + 32 + 86 78 +
Planta parcial da vinha de Vale da Parra. Cada quadrícula corresponde a uma videira. A numeração corresponde às plantes de onde foram obtidos os isolamentos de GFLV designados genéricamente por P/VPnn. As videiras assinaladas com (+) ou com (-) foram testadas apenas por ELISA. A vinha apresenta mais de 20 anos; está implantada em terreno areno-franco e está infestada com Xiphinema index . A distancia na linha é de 1,5 m e na entrelinha de 4 m.
3-Resultados 3.1 Tipificação genómica de GFLV
3.1.1 Polimorfismos conformacionais monocatenários (SSCP)
Para familiarização e adaptação do método às condições de trabalho existentes efectuaram-se alguns ensaios exploratórios com diversos isolamentos. (Fig. 3.1.1-1).
Fig. 3.1.1-1. Estudo de algumas condições de análise por SSCP. A- Diversos isolamentos oriundos de Dois Portos. Estão assinaladas as bandas correspondentes a moléculas monocatenárias (ss-DNA) e bicatenárias (ds-DNA). B- Isolamento U9, desnaturado 1) com NaOH ou 2) por meio de calor. Electroforese em gel de 6,5 % de poliacrilamida durante 15 h a 40 V. M1, marcador. C- Análise por SSCP mediante amplificação assimétrica. 3) método normal, 4) reamplificação com iniciador de jusante, 5) reamplificação com iniciador de montante. D- Isolamento U9 capturado com anticorpos 6) para GFLV e 7) para ArMV. Em A a electroforese foi efectuada em gel de 6,5 % de poliacrilamida contendo 10 % de glicerol, durante 15 h a 40 V; nos restantes casos foi feita sem glicerol, durante 15 h a 80 V. Todos os géis foram corados com nitrato de prata. Nos painéis B,C e D estão assinaladas as posições das bandas monocatenárias.
Verificou-se, a avaliar pela intensidade da banda correspondente ao DNA bicatenário, que um dos principais problemas era a renaturação ou não desnaturação da totalidade das moléculas bicatenárias, o que, limitando o rendimento em moléculas de DNA monocatenário, dificultava a detecção destas. Para ultrapassar este problema tentou-se outro método de desnaturação (Fig. 3.1.1-1,B), por meio de NaOH, (Yap e McGee, 1992); embora se conseguisse diminuir ligeiramente a intensidade da banda de DNA bicatenário, este método originava um intenso rasto que dificultava a análise dos resultados. Outra possível solução para evitar os problemas associados à desnaturação incompleta ou renaturação foi apresentada por Lazaro e Estivill (1992): o DNA é re- amplificado em duas reacções separadas, cada qual apenas com um iniciador (amplificação assimétrica). Cada uma das reacções produz apenas uma das cadeias monocatenárias, que não pode portanto hibridar com a outra cadeia. Um exemplo desta variação é apresentado na Fig. 3.1.1-1,C mas resulta pouco prático.
O fraco rendimento em moléculas monocatenárias é assim um dos principais óbices ao emprego de métodos de detecção como a coloração por nitrato de prata, que são muito menos sensitivos do que os métodos radioactivos. No entanto ainda assim foi possível na maioria dos casos distinguir as bandas correspondentes às moléculas monocatenárias.
Para melhorar a distinção entre os isolamentos verificou-se ser necessário prolongar o fraccionamento electroforético, tendo a banda correspondente à molécula bicatenária deixado de ser visível no gel. Passou a utilizar-se habitualmente um fraccionamento de 15 h a 80 V (tensão constante).
Para verificar se a origem dos anticorpos empregues na imunocaptura teria efeito nos resultados fizeram-se alguns ensaios comparativos, com IgG dos antisoros U9 e Cl10, não se tendo observado diferenças (resultados não apresentados). Este ensaio foi também efectuado com anticorpos para o GFLV e para o ArMV (Fig. 3.1.1-1,D) tendo-se observado que o padrão obtido era idêntico em ambos os casos. Assim, tal como sugerido no Cap. 2, ambos os anticorpos parecem conduzir à captura de populações análogas de genomas virais.
Alguns isolamentos originavam mais do que duas bandas monocatenárias. Embora à priori não se possa excluir a possibilidade de o isolamento ser composto por uma população genómica multimodal (mistura de estirpes), é admissível a existência de mais do que uma conformação estável em determinadas condições de meio (Orita et al., 1989a, b).
A reproducibilidade da análise por SSCP é elevada desde que se mantenham constantes as condições em que é efectuado o fraccionamento electroforético (Orita et al., 1989b; Fan et al., 1993). Algumas repetições de ensaios efectuados com o mesmo extracto, sujeito a amplificação e fraccionamento electroforético em separado ou efectuados com extractos obtidos de diferentes partes da mesma planta (Fig. 3.1.1-2), mostram esta reproducibilidade. No entanto variações das condições ambientais durante o fraccionamento, principalmente de temperatura, são suficientes para alterar a posição das bandas. Para obviar os efeitos de eventuais variações as conclusões respeitantes a comparações entre isolamentos devem ser feitas apenas dentro de cada gel. Mesmo assim, desde que as condições de fraccionamento não sejam muito distintas, é possível observar uma forte semelhança nos padrões obtidos em ocasiões distintas (isolamento U9, Fig. 3.1.1-1,B,D e Fig. 3.1.1-2).
Fig. 3.1.1-2 Reproducibilidade da análise por SSCP. A- O mesmo extracto das plantas 13VP e 14VP foi amplificado em ocasiões distintas e analisado em simultâneo. B- Extractos obtidos de diferentes partes da planta 12VP foram amplificados em separado e analisados lado a lado. C- Idem, com extractos da planta 3VP. Electroforese em gel de poliacrilamida a 6,5 %, durante 15 h a 40V. Coloração do gel com nitrato de prata.
Fig 3.1.1-3 Análise por SSCP de diversos isolamentos obtidos na mesma vinha. A numeração refere-se à identificação das plantas de onde foram colhidas as amostras (ver mapa em material e métodos). Cada conjunto agrupado sob um traço é proveniente de plantas contíguas na mesma linha da vinha. Electroforese em gel de poliacrilamida a 6,5 %, durante 15 h a 80 V. Coloração com nitrato de prata.
Uma vez acertadas as condições mais adequadas, empregou-se esta metodologia para efectuar alguns ensaios exploratórios da variabilidade de isolamentos obtidos na mesma vinha (Vale de Parra, ver planta em Materiais e Métodos). Surpreendentemente observou-se uma grande variabilidade dos padrões obtidos (Fig. 3.1.1-3), mesmo em casos em que as fontes dos isolamentos eram plantas contíguas na linha. Por outro lado, os ensaios de reproducibilidade da análise por SSCP (Fig. 3.1.1-2) e outros de RSP (ver adiante) efectuados a partir de extractos de diferentes partes da mesma planta sugerem homogeneidade de distribuição genómica do vírus em cada planta. Assim a variabilidade ocorreria essencialmente entre isolamentos de diferentes plantas.