Determining time periods

Para manter as atividades fisiológicas em um nível favorável, as células das leveduras necessitam de uma fonte de carbono, prótons dissociados no meio (pH baixo), oxigênio, nitrogênio (sal de amônia, ureia, aminoácidos), fósforo, potássio, magnésio, fonte de enxofre, cátions inorgânicos e fatores de crescimento (como as vitaminas exigidas em níveis de μmoles) (Walker, 1998; Walker, 2004). Embora a matéria-prima comercial seja rica em nu- trientes necessários ao crescimento das leveduras, suplementações nutri- cionais com fosfato e nitrogênio são necessárias para aumentar o acúmulo de biomassa e produção de etanol. As necessidades de suplementação nutri- cional dependem da linhagem de levedura, número de células presentes no inóculo e a composição da matéria-prima (Arshad et al., 2008; Mukhtar et al., 2010). O catabolismo das células da levedura Saccharomyces cerevisiae é muito mais preservado durante a privação de uma fonte de carbono do que uma fonte de nitrogênio (Nilsson et al., 2001). Assim, altos níveis de fontes de carbono associados a baixos níveis de fontes de nitrogênio são as causas mais comuns do desempenho pobre das fermentações (Pretorius, 2000).

Exigências por fontes de nitrogênio e fosfato

Nitrogênio e fósforo constituem as principais exigências nutricionais para o crescimento e eficiência da produção de etanol, pois estão presen- tes nos ácidos nucleicos e fosfolipídios. A suplementação com DAP (di- -amônio-fosfato) tem sido usada como fontes de fosfato e nitrogênio. A

suplementação com DAP apresenta um ótimo entre 32 a 54 ppm depen- dendo da matéria-prima. Em concentração ótima de DAP, a quantidade de ácido acético produzido diminui com ganhos em rendimentos de etanol (Mukhtar et al., 2010). Por outro lado, quando o DAP é adicionado ao me- laço em concentrações maiores que 150 ppm, a ureia reduz a formação de etanol (ibidem).

Quando as células são submetidas ao estresse osmótico, alguns ami- noácidos (histidina, leucina, lisina, arginina, alanina, aspártico, triptofano) intracelulares diminuem nas primeiras horas de fase logarítmica em meio contendo 20g.L-1 _{de glicose. Isso sugere que a adição de aminoácidos in-} duz a síntese de proteínas em altas concentrações de açúcar no meio. Na fase estacionária, a disponibilidade de aminoácidos internos diminui ainda mais em função da falta de nutrientes (Pham; Wright, 2008). A elevação nos níveis de viabilidade e proliferação celular, bem como a ativação da via glicolítica podem ser conseguidas com a suplementação do meio com um coquetel de aminoácidos (Pham; Wright, 2008).

Em condição de exaustão da fonte de carbono, a maior perda das célu- las consiste na redução do nível de energia disponível (Thomsson et al., 2003). A falta da fonte de carbono reduz o pool de ATP das células a valores inferiores a 0,1 μmol.g-1_{, enquanto as células em estado de jejum por falta de} nitrogênio apresentam um pool de ATP elevado a 6 μmol.g-1_{. Adição de pe-} quenas concentrações de glicose (0,1g.L-1 _{para 1,0g.L}-1 _{de células iniciais)} a uma cultura, no início do estado de jejum ou mesmo em sua fase estacio- nária mais avançada, permite às células preservarem sua atividade fermen- tativa. A adaptação ao estado de jejum nutricional pode ser conseguida por meio de uma diminuição gradual de nutrientes (ibidem).

A adaptação ao etanol produzido

As células da levedura S. cerevisiae, adaptadas ao crescimento em meios contendo concentrações crescentes de etanol, não perdem atividade de crescimento em um meio contendo uma concentração alta de etanol (Dinh et al., 2008). No entanto, o teor de lipídios das membranas dessas células adaptadas bem como seus volumes (células maiores) são diferentes das cé- lulas não adaptadas. Isso sugere que a adaptação ao etanol está relacionada com o ciclo de divisão celular.

A COMPLEXIDADE DA PRODUÇÃO DO BIOETANOL EM FERMENTAÇÕES ABERTAS... 181

Necessidades de cátions inorgânicos

As necessidades nutricionais das leveduras por minerais são bastante conhecidas e foram extensivamente revisadas. O papel dos minerais está descrito em detalhes abaixo (Walker, 1998; Walker, 2004).

Potássio: constitui 1% a 12% da massa seca da levedura. O potássio atua como o cofator principal de enzimas envolvidas com a fosforilação oxidati- va, síntese de proteínas e catabolismo de hidratos de carbono.

Sódio: concentrações elevadas de íons de sódio são prejudiciais às funções celulares, mas as células dispõem de mecanismos de extrusão de cátions.

Cálcio: este cátion desempenha um papel fundamental como mensageiro secundário na transmissão de estímulos externos em células de eucariotos. Além disso, o cálcio se liga à parede das células participando da floculação e apresentando uma ação antagônica quanto ao consumo de magnésio, blo- queando processos metabólicos essenciais. No entanto, quando utilizado em quantidades apropriadas (0,5 mmol.L-1 _{a 1,5 mmol.L}-1_{), ocorrem au-} mentos na velocidade da fermentação e do crescimento da célula. O cálcio está relacionado com o aumento da atividade da ATPase das membranas e níveis de proteína (Li et al., 2010).

Magnésio: é o metal mais abundante das células dos seres vivos, sendo essencial para a multiplicação celular. Constitui 0,3% da célula viva em peso seco e atua como um cofator essencial para cerca de 300 enzimas envolvidas com as vias metabólicas. Apesar de sua importância, o conhecimento das funções deste íon e da regulação dos seus transportadores ainda é limitado em Saccharomyces cerevisiae (Pisat et al., 2009).

Zinco: estes íons podem ser tóxicos, pois afetam a permeabilidade das membranas quanto a entrada de potássio, causando diminuição na atividade de fermentação. Em concentrações de zinco acima de 3,0 mg.L-1_{, a concen-} tração de etanol produzido diminui (Tosun; Ergun, 2007). São necessários aproximadamente 7 x 108 _{átomos de zinco/células para o crescimento ótimo} (Simm et al., 2007). Nas células crescidas em meio contendo zinco, este me- tal se acumula nos vacúolos por muitas divisões celulares consecutivas, mes- mo quando o meio passa a se tornar pobre em relação a este íon (ibidem).

Níquel: este cátion não é um nutriente essencial, mas pode se acumular nas células da levedura Saccharomyces cerevisiae. Porém, o crescimento e os teores de proteína interna diminuem quando a concentração de níquel no meio for superior a 20 mg.mL-1 _{(Neelam; Sood, 2008).}