Determination of the target specificities of candidate compounds

A existência de expressão diferencial das isoformas α, β e γ do gene ADAM23 em linhagens tumorais e em amostras de tecidos normais, bem como a expressão das isoformas nos derivados clonais da linhagem MDA-MB-435 utilizados nos ensaios funcionais (VV1, VV2, A8, A10, B2, B5, G25, G40 e A23neg), foram avaliadas pelo método de quantificação absoluta, que determina o número de cópias do transcrito de interesse na amostra em análise por meio da comparação com uma curva padrão construída com quantidades conhecidas do transcrito-alvo.

Nesta parte do estudo, além do gene HMBS, incluímos outro controle endógeno, o gene PUM1 [Homo sapiens pumilio homolog 1 (Drosophila), variante 1, NM_001020658], cujos iniciadores foram desenhados manualmente em nosso laboratório e estão demonstrados na tabela 1(página 55, de Material e Métodos).

Para tanto, fragmentos das três isoformas do gene ADAM23 e dos controles endógenos HMBS e PUM1 foram amplificados a partir de cDNA da linhagem MDA- MB-435 nas mesmas condições da reação de amplificação em tempo real, purificados e clonados empregando-se o kit pGEM T Easy _{(Promega), seguindo as} instruções do fornecedor. O produto de ligação foi utilizado para transformar bactérias E. coli (DH10B) eletrocompetentes (SAMBROOK e RUSSEL 2001), as quais foram selecionadas em placas contendo 40µg/ml X-gal, 24µg/ml IPTG e 100µg/mL ampicilina. A presença do inserto foi verificada através de reações de amplificação com iniciadores específicos para sequências do vetor de clonagem. Os

produtos das reações foram analisados por eletroforese e uma colônia contendo cada um dos fragmentos de interesse foram inoculadas em 2ml de meio de cultura Circle Grow (Bio 101, Inc.) contendo 100 g/ml ampicilina e deixadas em shaker a 37ºC durante a noite. No dia seguinte, após a obtenção do pellet celular, realizou-se a extração de DNA plasmidial, utilizando-se o kit Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega), seguindo as especificações do fornecedor. Os produtos da extração foram analisados por eletroforese e quantificados em espectrofotômetro, seguindo-se o sequenciamento para confirmação dos fragmentos clonados. O sequenciamento foi realizado segundo a técnica de terminação com dideoxinucleotídeos descrita por SANGER et al. (1977), utilizando-se o kit DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing (Amersham Biosciences), seguindo as instruções do fornecedor. Os produtos do sequenciamento foram submetidos a eletroforese por capilaridade no sequenciador automático de DNA ABI 3100 (Applied Biosystems).

Uma vez confirmada a presença dos fragmentos de interesse nos plasmídeos purificados e sequenciados, estas amostras foram utilizadas para re-amplificar cada um dos fragmentos. Nas reações de re-amplificação, aproximadamente 100.000 cópias de cada plasmídeo foram utilizadas como molde em reações com volume final de 20µl contendo 1X tampão Taq Polimerase (Invitrogen), 1.5mM MgCl2, 200µM dNTPs, 1U Taq polimerase (Invitrogen) e os mesmos iniciadores específicos utilizados nas reações de amplificação em tempo real para amplificar cada fragmento, de acordo com a sequência e a concentração dos iniciadores descritas na tabela 1. As condições de amplificação foram: desnaturação do cDNA por 5 minutos a 94ºC e, em seguida, 35 ciclos de desnaturação a 94ºC por 45 segundos, anelamento a 60ºC por 45 segundos e extensão a 72ºC por 1 minuto. Ao final, foi realizado 1 ciclo de extensão das moléculas por 6 minutos a 72ºC.

Os produtos das reações de re-amplificação foram analisados por eletroforese em gel de L.M.P. agarose 3% (Low Melting Point Agarose, GibcoBRL). Em seguida, os fragmentos foram extraídos do gel utilizando-se o kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN). As concentrações dos produtos amplificados e purificados foram analisadas no fluorímetro Qubit (Invitrogen), empregando-se o kit Quant-iT double strand DNA High Sensitivity Assay (Invitrogen). Cada amostra foi quantificada em duplicata, e a média dos valores obtidos para cada uma delas foi utilizada para calcular o número de moléculas existente em cada microlitro de solução.

Para determinar exatamente o número de cópias de cada transcrito que era colocado na reação de amplificação, foi feito o cálculo da massa de uma molécula a partir do tamanho e da composição de bases de cada fragmento clonado. Após a obtenção da massa de 1 molécula, calculou-se o volume necessário de cada solução dos produtos amplificados para se obter 1, 10, 100, 1.000, 10.000 (...) moléculas em cada reação de amplificação. Foram feitas diluições seriadas a fim de se obter as concentrações para os diferentes pontos na curva de amplificação padrão. Após alguns testes, optou-se por construir a curva com cinco ordens de magnitude, utilizando os seguintes pontos: 102_{, 10}3_{, 10}4_{, 10}5 _{e 10}6 _{moléculas. A} diluição dos produtos de PCR em uma solução contendo 20ng/µl de um DNA plasmidial facilitou a obtenção de duplicatas idênticas nos pontos utilizados para a construção da curva-padrão, principalmente nas reações realizadas com as menores quantidades de moléculas, como 100 e 1.000, cujos produtos amplificam em CTs muito altos.

A curva-padrão foi realizada simultaneamente às reações de amplificação nas amostras de interesse todas as vezes em que estas foram conduzidas. Dessa forma, a quantidade de cópias do transcrito de interesse na amostra analisada foi obtida

plotando-se o CT da amostra na curva-padrão construída com quantidades conhecidas do transcrito. Ao final de cada reação de amplificação, analisou-se a correlação entre os pontos utilizados para construir a curva-padrão. Apenas as curvas que apresentaram coeficiente de correlação linear (R2_{) entre os pontos maior}

do que 0.995 e eficiência de amplificação (demonstrada pelo slope da curva, E=10(-1/slope) _{– 1) maior do que 95% foram incluídas na análise. Por fim, o número de} cópias obtido para o transcrito de interesse foi normalizado pela média entre o número de cópias dos transcritos dos genes endógenos HMBS e PUM1, a fim de normalizar a quantidade e a qualidade do cDNA nas diferentes amostras.