Detection approaches

2.9.1. E

C

C

As células da linha celular tumoral HCT116 foram cultivadas em frascos de cultura de 25 cm2 _{numa densidade celular de 2x10}5 _{células/mL e incubadas a 37 °C, 5 % (v/v) de CO}

2 e 99 % de humidade relativa durante 24 h. Posteriormente, as células foram tratadas com 2 mL de uma solução controlo de DMSO a 0,15 % (v/v) e 2 mL de uma solução do composto ZM V numa concentração de 0,07 µM (solução preparada por diluição da solução stock em meio de cultura), e incubadas 24 h a 37 °C, 5 % (v/v) de CO2 e 99 % de humidade relativa. Posteriormente transferiram-se para tubos de centrífuga as células tripsinizadas, centrifugaram-se por 5 min a 2500 rpm e lavaram-se três vezes com 1 mL de PBS 1x gelado, eliminando de seguida os sobrenadantes.

2.9.2. E

,

P

P

E

P

Para extracção do extracto de proteína total preparou-se, em gelo, uma solução de lise constituída por 1x de inibidores de fosfatases (PhosStop, Roche, Basel, Suíça), 1x de inibidores de proteases (complete Mini, Roche), 1 % (p/v) de ditiotreitol (DTT; Promega), 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF; Sigma), em tampão de lise NaCl-Tris-EDTA (150 mM NaCl; 50 mM Tris; pH=8; 5 mM EDTA) e 2 % (p/v) de NP-40 (ThermoScientific). As células obtidas foram ressuspensas em 200 µL desta solução e incubou-se em gelo cerca de 1 h. Ao fim desse tempo, observaram-se preparações de 5 µL das amostras ao microscópio de fluorescência Olympus BX51 para verificar se as células se encontravam lisadas e, foram vortexadas cerca de 1 min para promover a lise completa das células. De seguida, centrifugou- se a 14000 xg durante 10 min e recuperaram-se os sobrenadantes.

Para precipitação e purificação dos extractos de proteína total utilizou-se o 2-D Clean-Up Kit (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido), de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante, até ao passo de adição do wash buffer e do wash additive, em que foi efectuada uma incubação overnight a -20 °C. Posteriormente, ressuspenderam-se os sedimentos em 150 µl de solução de reidratação constituída por 120 µL de tampão de reidratação (8 M de Ureia

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(Sigma), 2 % (p/v) de CHAPS (GE Healthcare), 0,5 % (v/v) de tampão IPG pharmalyte pH 3-10 (GE Healthcare) e vestígios de azul de bromofenol (Riedel-de Haël, Saint Louis, EUA)), e ainda 0,6 µL de DTT a 10 % (p/v), 0,6 µL de PMSF a 100 mM, 15 µL de inibidores de fosfatases e 15 µL de inibidores de proteases, adicionados imediatamente antes da aplicação da solução de reidratação. As amostras foram mantidas à temperatura ambiente durante pelo menos 2 h. Por fim, centrifugaram-se as amostras a 14000 xg por 15 min, recuperando os sobrenadantes que contêm as proteínas solubilizadas.

2.9.3. Q

E

P

T

O extracto de proteína total foi quantificado imediatamente antes da focagem isoeléctrica utilizando o Pierce Protein Assay Kit (ThermoScientific). Traçou-se uma recta de calibração de padrões Albumina sérica bovina (BSA, do inglês Bovine serum albumin) com concentrações desde 125-1000 µg/mL, preparados pela adição de 50 µL de cada uma das soluções padrão e 750 µL do reagente de Pierce. Para quantificação das amostras foram preparadas soluções usando 10 µL de amostra, 90 µL de água destilada e 1,5 mL de reagente de Pierce. As soluções permaneceram durante 5 min à temperatura ambiente. De seguida, mediu-se a absorvância a 660 nm no NanoDrop2000 utilizando uma solução de 50 µL de água destilada em 750 µL de reagente de Pierce como zero da recta de calibração.

2.9.4. E

B

(2-DE)

A electroforese bidimensional permite a separação das proteínas através de duas etapas: a focagem isoeléctrica e a electroforese em géis de SDS-PAGE. A focagem isoeléctrica, ou 1ª dimensão, permite a separação das proteínas consoante o seu ponto isoeléctrico. A 2ª dimensão, realizada pela utilização de géis SDS-PAGE, permite a separação das proteínas de acordo com a sua massa molecular.

2.9.5. F

I

Para a realização da focagem isoeléctrica utilizaram-se 200 µg do extracto proteico total. O volume correspondente aos 200 µg de extracto de proteína total foi distribuído ao longo do suporte de tiras de 7 cm IPG strip holder (GE Healthcare), colocando-se por cima uma tira Immobiline Dry strip pH 3-10 NL de 7 cm (GE Healthcare), de modo que o gel ficasse em contacto com a amostra e não se formassem bolhas entre o gel e a amostra. Selou-se o suporte com 750 µL de Drystrip Cover Fluid (GE Healthcare) e colocou-se a respectiva tampa. Os suportes foram posteriormente dispostos no sistema de isofocagem ETTANIPGphor3 IEF (GE Healthcare), e a focagem isoeléctrica foi realizada através do programa indicado na Tabela 2.5.

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Tabela 2.5 – Programa utilizado na focagem isoeléctrica

Passo Duração Voltagem (V) Temperatura (°C)

1 12 h 30 20 2 30 min 100 3 30 min 500 4 30 min 1000 5 1 h 5000

2.9.6. SDS-PAGE

Antes da realização dos géis SDS-PAGE as tiras foram removidas dos suportes e equilibradas, durante 15min com agitação horizontal, em 5 mL de solução de equilíbrio (1,5 M de Tris-HCl pH 8,8 (Merck), 360,35 g/L de ureia (Scharlau), 354 mL/L de glicerol 30 % (v/v) (Panreac), 20g/L de dodecil-sulfato de sódio (SDS, do inglês: Sodiumdodecyl sulfate; Riedel-de Haën), vestígios de azul de bromofenol) suplementada com 1% (p/v) de DTT. De seguida, as tiras foram transferidas para uma nova solução de equilíbrio suplementada com 2,5% (p/v) de iodocetamida (GE Healthcare) onde permaneceram durante 15 min com agitação horizontal.

Para a segunda dimensão da electroforese bidimensional, prepararam-se géis de poliacrilamida a 12,5 % (v/v) contendo: 4 mL de acrilamida/bis-acrilamida 30 % (Merck), 2,5 mL de tampão Tris-HCl 1,5 M pH 8,8; 3,5 mL água destilada, 75 μL de persulfato de amónia (APS, do inglês: Ammonium Persulfate; Biorad, Califórnia, EUA) e 10μL tetrametiletilenodiamina (TEMED, do inglês tetramethylethylenediamine; Sigma). O sistema de SDS-PAGE Mini- PROTEAN®3 System (BioRad) foi previamente montado e os géis colocados nos moldes, selando-os com água destilada, e deixando-os polimerizar. Eliminou-se a água com inversão dos moldes e papel de filtro e as tiras foram colocadas por cima dos géis de poliacrilamida, juntamente com o marcador de pesos moleculares HyperPAGE I (Bioline), selando-se de seguida com uma solução de agarose 0,5 % (p/v) (Lonza, Basel, Suíça) em tampão de electroforese (3,79 g/L de Tris-base, 18 g/L de glicina (Panreac), 1,25 g/L SDS e vestígios de azul de bromofenol). Iniciou-se a electroforese a 30 V durante 30 min e seguidamente a 1500 V até o azul de bromofenol ser eliminado para o tampão de electroforese.

2.9.7. R

G

Os géis resultantes foram corados a quente (2 min no microondas a 900 W) numa solução contendo três pastilhas de PhasTGel™ Blue R (Coomassie R350) (GE Healthcare) dissolvidas em 1 L de ácido acético a 10 % (v/v) (Panreac) em água destilada, sendo aquecidos em intervalos de 20 min por três vezes. Para a revelação dos géis realizaram-se várias lavagens com água destilada, aquecida nas mesmas condições referidas anteriormente. Os géis foram digitalizados através do scanner PIXMA M250 (Canon) e analisados no programa Melanie 7.0 (GeneBio, Genebra, Suíça). A análise foi realizada por detecção automática dos spots, identificação dos spots de proteínas, correspondência dos spots entre os diferentes géis e

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determinação da intensidade/expressão de cada spot. A variação dos níveis de expressão de cada proteína foi calculada a partir da razão entre a intensidade de cada um dos spots das amostras pela intensidade de cada um dos spots dos controlos. Os spots, cuja expressão foi considerada significativa (≤ 0,7 e ≥ 1,5), foram excisados dos géis e analisados por espectrometria de massa Maldi-TOF.

O ensaio foi realizado em triplicado.