Det kvalitative forskningsintervjuet

3.7.1 – Ensaios biológicos realizados sobre as formigas cortadeiras 3.7.1.1 – Obtenção das formigas cortadeiras

Os ensaios por ingestão com as operárias de Atta sexdens rubropilosa foram realizados no Centro de Estudos de Insetos Sociais (CEIS) UNESP – Rio Claro/SP pela aluna Tais Garcia Freitas sob orientacão do Prof. Dr. Odair Corrêa Bueno.

Neste ensaio as operárias foram retiradas aleatoriamente de formigueiros mantidos em laboratório. Para manutenção das formigas isoladas do formigueiro foi utilizada dieta sólida artificial constituída por: 5,0% glicose, 1,0% peptona bacteriológica, 0,1% extrato de levedura e 1,5% ágar bacteriológico dissolvidos em 100 mL de água destilada.

3.7.1.2 – Preparação da dieta artificial e metodologia do ensaio para as operárias

A atividade inseticida sobre as formigas cortadeiras foi realizada por ingestão, através da incorporação do material vegetal na dieta artificial sólida. Após a mistura destes componentes, a dieta foi levada ao forno de microondas por 4 minutos e logo em seguida, à autoclave por 15 minutos a uma temperatura de 120°C e 1 atm. A dieta ainda líquida foi entornada em placas de Petri de 10 cm de diâmetro, que após resfriamento e solidificação foram ou serão embrulhadas em papel filme e mantidas em geladeira, sendo utilizadas nos dias subseqüentes durante o período do experimento. Foi estipulado um período máximo 25 dias para a realização do experimento de toxicidade.

A dieta para manutenção das formigas (controle) ou a dieta acrescida do substrato a ser testado (tratamentos) foi colocada em papel alumínio na quantidade de 0,4 a 0,5 g/placa. A cada 24 horas a dieta foi ou será renovada. O material a testado foi pesado, dissolvido no mesmo solvente em que ocorreu

a extração e incorporado na dieta na concentração de 2 mg/mL (BUENO et al, 1997).

As formigas foram distribuídas em lotes de 50 operárias para cada tratamento, divididas em grupos de 10 formigas e mantidas em 5 placas de Petri. Essas placas foram colocadas em estufa com temperatura de 25° ± 1 ºC e umidade relativa acima de 70% e examinadas diariamente para retirada e anotação do número de formigas mortas.

A análise estatística foi realizada através do teste não paramétrico log- rank (p < 0,05), utilizando-se o software GraphPad, aplicativo Prisma 3.0.

3.7.2 – Ensaios biológicos realizados sobre Spodoptera frugiperda 3.7.2.1 – Obtenção da lagarta-do-cartucho do milho

Os ensaios biológicos com os extratos e frações de Rauia sp foram realizados no Laboratório de Bioensaios do Departamento de Química da Universidade Federal de São Carlos, em colaboração com as alunas de iniciação científica Alini Roberta Alves e Érica Elaine Kuba, sob a orientação da Dra. Andréia P. Matos. O Laboratório de Bioensaios é mantido a 25 ± 1oC, umidade relativa de 70 ± 5% e fotofase de 12 h.

Para realização dos testes foi mantida em laboratório criação de S. frugiperda, onde as lagartas foram alimentadas com dieta artificial (TABELA 3.5, p. 80) (KASTEN et al., 1978; PARRA, 1986) e os adultos com solução de mel 10%.

3.7.2.2 – Ensaios de ingestão sobre Spodoptera frugiperda

Para realização dos bioensaios, cada extrato foi solubilizado em uma pequena quantidade (10 mL) de uma mistura de solventes na proporção 3:4:3 hexano, diclorometano e metanol, respectivamente e misturado ao ácido ascórbico. Esta mistura foi seca para que todo o solvente fosse evaporado e posteriormente foi incorporada à dieta artificial (KASTEN et al., 1978) para S. frugiperda (TABELA 3.5, p. 80), com o cuidado de adicioná-lo ao final, quando

a dieta estava à temperatura de 50oC. Os extratos e frações foram incorporados à dieta artificial na proporção de 100 mg de extrato para 100 g de dieta (1000 ppm), ou seja, para cada tratamento utilizou-se 300 mg de amostra uma vez que utilizam-se 30 tubos de vidro. A incorporação da mistura à dieta artificial vem sendo realizada com sucesso no Laboratório de Bioensaios (BATISTA-PEREIRA et al., 2002; MATOS et al., 2006; LEITE et al., 2008). Além das dietas correspondentes a cada tratamento, preparou-se uma dieta testemunha (controle), sem extrato, utilizando-se a mistura de solventes em que foram solubilizados os extratos.

T

TAABBEELLAA33..55: Descrição da dieta artificial para S. frugiperda para 50 tubos :

Componentes Quantidade Feijão carioca 82,5 g Gérmen de trigo 39,6 g Levedura 25,3 g Ácido ascórbico 2,6 g Ácido sórbico 0,8 g Nipagin 1,1 g Formaldeído (40%) 6,3 Ml Tetraciclina 50 mg Agar 10,3 g Água 597,5 mL

Após a preparação, as dietas foram vertidas em tubos de vidro (8,5 x 2,5 cm), previamente esterilizados em estufa a 170 oC por 1 hora e tampados com algodão hidrófugo. Após a colocação da dieta, os tubos foram mantidos por 24 horas em grades de arame para eliminação do excesso de umidade (gotículas) de suas paredes. A seguir, foi feita a inoculação das lagartas

recém-eclodidas de S. frugiperda, utilizando-se uma lagarta por tubo de vidro. Foram utilizados 30 tubos para cada tratamento.

As pupas obtidas foram pesadas, 1 dia após a pupação e transferidas para copos plásticos de 50 mL de capacidade, onde permaneceram até a emergência dos adultos.

Foram avaliados os seguintes parâmetros: duração das fases larval e pupal, peso das pupas e porcentagem de insetos mortos (mortalidade) na fase larval e no ciclo total de desenvolvimento.

Para os resultados dos ensaios realizados, o delineamento experimental foi inteiramente casualizado. Nestes bioensaios utilizaram-se médias de agrupamento de dados no total de 6 repetições por tratamento. A unidade experimental foi constituída por 5 tubos com uma lagarta cada. Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) (ZAR, 1984). A comparação entre médias dos tratamentos foi feita através do Teste de Tuckey, ao nível de 5% de probabilidade.

3.7.2.3 – Ensaios de toxicidade aguda sobre Spodoptera frugiperda

Os ensaios biológicos com extratos brutos e frações de Rauia sp foram realizados no Laboratório de Bioensaios do Departamento de Química da UFSCar, nas condições descritas no item anterior.

Os ensaios de toxicidade aguda basearam-se na metodologia

descrita por PAULA et al. (2000). Para realização dos bioensaios foram

preparadas soluções dos extratos em acetona em concentrações diferentes. Foram utilizados cinco grupos de 10 larvas de S. frugiperda no segundo ínstar (5 dias), onde cada grupo foi transferido para placas de Petri. As médias dos pesos dos cinco grupos de insetos foram obtidas pelas medidas realizadas em balança analítica. Em cada inseto foi aplicado topicamente 1 μL da solução do extrato em acetona, via uma micro-seringa. Para evitar a possível morte do inseto, em cada grupo de larvas foram colocadas pequenas porções (300,0 mg) da dieta artificial. Este processo foi realizado uma hora

após a aplicação da solução. O controle foi realizado sob as mesmas condições, 1 μL de acetona foi aplicado em cada inseto.

A mortalidade dos insetos foi verificada após 48 horas. Todos os experimentos e o respectivo controle foram realizados em 5 replicatas. Os

ensaios com os extratos e frações de Rauia sp foram realizados na