Descriptive analysis

5.4.1 Extração de DNA

A extração de DNA total foi realizada seguindo o protocolo descrito por Fiore et al. (2000), partindo de aproximadamente 3 mL de cultura em meio líquido concentrados por centrifugação. As células concentradas foram, inicialmente, lavadas com água ultrapura esterilizada e posteriormente com 1 mL da solução tampão I (EDTA 5 mM, Tris-HCl 50 mM pH 8,0 e NaCl 50 mM). O pélete foi então ressuspendido em 200 μL da solução tampão II (Tris-HCl 50 mM pH 8,0 e EDTA 50 mM) e as células lisadas por choque térmico com resfriamento em nitrogênio líquido e aquecimento em banho-maria a 55 ºC. Em seguida adicionou-se Proteinase K (2 μg.mL-1_{), sendo as amostras incubadas por 10 minutos a 55 ºC.}

Após a lise, foram adicionados 600 μL de tampão de extração pré-aquecido a 55 ºC (CTAB 3 %, NaCl 1,4 M, EDTA 20 mM, Tris-HCl pH 8,0 100 mM, Sarkosyl 1 % e β-mercaptoetanol 1 %) e incubou-se as amostras em banho-maria a 55 ºC por 30 minutos. Em seguida, 800 μL de clorofórmio e álcool isoamílico na proporção de 24:1 (v/v) foram adicionados aos tubos, os quais foram submetidos à centrifugação por 5 minutos a 7000 × g. Um volume de 500 μL do sobrenadante foi recuperado e transferido para um novo microtubo, ao qual foram adicionados 1000 μL de NaCl 4 M e 50 μL de uma suspensão de sílica (20 mg.mL-1 _{em tampão PBS),}

seguido da incubação a 55 ºC por 10 minutos. Os tubos foram centrifugados por 30 segundos a 7000 × g, o sobrenadante foi descartado e o pélete foi lavado duas vezes com 250 μL da solução de lavagem (NaCl 50 mM, Tris-HCl pH 7,5 10 mM, EDTA 2,5 mM e etanol 50 %).

Seguiu-se a secagem do pélete a 37 ºC, sua reidratação com 30 μL de água ultrapura esterilizada, ressuspensão, incubação em banho-maria a 45 ºC durante 10 minutos e nova centrifugação a 7000 × g por 30 segundos. Por fim, o sobrenadante contendo o DNA foi recuperado e transferido para um novo microtubo esterilizado, e armazenado a - 20 ºC.

5.4.2 Amplificação do gene 16S RNAr

A amplificação parcial do gene 16S RNAr (aproximadamente1400 pb) foi realizada utilizando o conjunto de iniciadores 27F1 (5´AGAGTTTGATCCTGCTCAG 3´) e 1494Rc (5´TACGGCTACCTTGTTACGAC 3´) (NEILAN et al., 1997). Essa amplificação foi feita em reação contendo: tampão para a reação PCR 1X (20 mM Tris HCl pH 8,4; 50 mM KCl), 0,2 mM de cada dNTP, 3 mM MgCl2, 1,5 U de Platinum Taq DNA Polimerase (Invitrogen,

Carlsbad, CA, USA), 20-50 ng de DNA e 5 µM de cada iniciador; em um volume final de 25 μL. A reação foi realizada na seguinte ciclagem térmica: 95 ºC/3 min; 30 ciclos 94 ºC/10 s, 50 ºC/20 s, 72 ºC/1 min; extensão final a 72 ºC/7min.

Na amplificação contemplando o espaço intergênico (ITS) dos genes 16S e 23S RNAr (16S-23S ITS), utilizou-se o mesmo iniciador direto 27F1, porém com o reverso 23S30R (5´-CTTCGCCTCTGTGTGCCTAGGT -3´) (TATON et al., 2003). A ciclagem ocorreu com desnaturação inicial a 94 ºC/5 min, 10 ciclos de 94 ºC/45 s, 57 ºC/45 s, 68 ºC/2 min, 25 ciclos de 92 ºC/45 s, 54 ºC/45 s, 68 ºC/2 min, e extensão final a 68 ºC/7 min.

A especificidade das reações foi confirmada por eletroforese em gel de agarose 1% (m/v) contendo o marcador de tamanho e concentração Low mass DNA ladder (Invitrogen).

5.4.3 Clonagem dos fragmentos gênicos

Os fragmentos gênicos amplificados foram ligados em vetor pGEM-T Easy Vector

Systems (Promega) conforme instruções do fabricante e inseridos em Escherichia coli DH5α

5.4.4 Seleção de clones

Uma vez que os iniciadores utilizados para amplificação do gene 16S RNAr reconhecem esta sequência gênica em todo o domínio Bacteria, e que as cianobactérias isoladas não são axênicas, há necessidade de se selecionar as colônias transformadas que abriguem o inserto referente ao 16S RNAr de cianobactérias e não de bactérias heterotróficas “contaminantes”. Tal seleção foi feita por amplificação de fragmentos menores (aproximadamente 450 pb) do 16S RNAr, utilizando os iniciadores descritos por Nübel e colaboradores (1997) os quais são específicos para regiões conservadas do gene 16S RNAr de cianobactérias. A reação foi realizada nas condições: tampão para reação PCR 1X (Tris HCl 20mM pH 8,4; KCl 50 mM), 0,2 mM de cada dNTP, 3 mM MgCl2, 1,5 U de Platinum Taq

DNA Polimerase (Invitrogen), 5 µM do iniciador CYA359F (5´ GGGGAATYTTCCGCAATGGG 3´), e da mistura dos iniciadores CYA781R a (5´

GACTACTGGGGTATCTAATCCCATT 3´) e CYA781R b (5´

GACTACAGGGGTATCTAATCCCTTT 3´) e 1 µL da suspensão de células transformadas proveientes de uma colônia obtida após a etapa de transformação, em um volume final de 25 µL. A reação foi realizada nas condições: 94 ºC/2 min; 35 ciclos de 94 ºC/1 min, 63 ºC/1min, 72 ºC/1 min, com extensão final a 72 ºC/7 min. A especificidade da reação foi confirmada por eletroforese em gel de agarose 1% (m/v).

5.4.5 Extração do DNA plasmidial

O DNA plasmidial contendo o inserto de interesse foi extraído pelo método de lise alcalina. Colônias de E. coli foram inoculadas em 3 mL de meio cultura Luria-Bertani Broth (LB) (25g/L) (Himedia, Mumbai, Índia) contendo ampicilina (100 μg.mL-1_{) e incubadas por}

14-16 horas a 37ºC sob agitação a 200 rpm. As células foram concentradas por centrifugação e re-suspendidas em 100 μL da solução I (Tris-HCl 25 mM, pH 8,0; EDTA 10mM e glucose 50 mM). Em seguida, foram adicionados 200 μL de solução de lise (NaOH 0,2 M; SDS 1 %). As amostras permaneceram em gelo por 10 min, foram centrifugadas a 15000 × g, por 15 min e o sobrenadante transferido para um novo tubo. A precipitação foi realizada com a adição de 270 μL de isopropanol e centrifugação a 15.000 × g por 10 min. O sobrenadante foi descartado e o pélete lavado com 250 μL de etanol 70%. Em seguida o pélete foi seco e

ressuspendido em 30 µL de água ultrapura contendo RNAse (1,5 µg.mL-1). As amostras foram incubadas a 37ºC por 30 min. O DNA plasmidial foi quantificado por eletroforese em gel contendo o marcador Low mass DNA ladder (Invitrogen) e armazenadas a – 20 ºC.

5.4.6 Sequenciamento

A PCR para o sequenciamento foi feita usando-se o kit BigDye Terminator v3.1 Cycle

Sequencing (Applied Biosystems/Life Technologies, Foster City, CA, USA). Para a reação

utilizou-se 1 μL de BigDye, tampão de reação1 X, 200 ng de DNA plasmidial e 5 µM do iniciador, num volume final de 10 μL. Foram utilizados os iniciadores externos:

M13F (5’- GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA- 3’) e M13R (5´ -

GAGCGGATAACAATTTCACACAGG - 3´); e para cobrir toda a sequência do 16S RNAr, foram utilizados também os internos: 357F (5’- CCTACGGGAGGCAGCAG -3’), 357R (5’- CTGCTGCCTCCCGTAGG -3’), 704F (5’- GTAGSGGTGAAATSCGTAGA -3’), 704R (5’- TCTACGSATTTCACCSCTAC -3’), 1114F (5’- GCAACGAGCGMRACCC -3’) e 1114R (5’- GGGTYKCGCTCGTTGC -3’) (LANE, 1991). As condições de amplificação foram as seguintes: desnaturação inicial por 1 min; 35 ciclos de 95 ºC/15 s, 50 ºC/15 s, 60 ºC/2 min.

As amostras foram então precipitadas com a adição de 25 mM de EDTA pH 8 e etanol absoluto em centrifugação refrigerada. O pélete foi então lavado com etanol 70% e seco no escuro à temperatura ambiente por 2 a 10 horas. Em seguida, as amostras foram ressuspendidas em formamida Hi-Di (Applied Biosystems/Life Technologies) e inseridas no sequenciador. O sequenciamento foi realizado em equipamento 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems/Life Technologies), em parcerias com o pesquisador Dr. Itamar S. Melo, da Embrapa Meio Ambiente e o professor Dr. Ricardo D. Coletta da Faculdade de Odontologia de Piracicaba (FOP-UNICAMP).

5.4.7 Processamento das sequências

As sequências geradas foram montadas e processadas para remoção de bases com baixa qualidade (índice de qualidade < 20) com o uso do pacote de programas Phred/Phrap/Consed (EWING; GREEN, 1998; EWING et al., 1998; GORDON; ABAJIAN; GREEN, 1998). As sequências foram comparadas com sequências depositadas no GenBank (NCBI), utilizando-se

a ferramenta BLASTn (ALTSCHÜL et al., 1990). Nos casos de análise de genes funcionais, foi utilizada também a ferramenta BLASTx.

As sequências geradas contedo o 16S-23S ITS foram analisadas com a ferramenta online RNAmmer 1.2 (LAGESEN et al., 2007) para identificação da região codificadora do gene 16S RNAr; tRNAscanSE (SCHATTNER; BROOKS; LOWE, 2005) para a identificação dos RNAs transportadores (tRNAs); e mFOLD (ZUKER, 2003) para a obtenção das estruturas secundárias das regiões Box B e D1-D1´. As sequências foram também avaliadas quanto à formação de quimeras utilizando o banco de dados Database Enabled Code for Ideal

Probe Hybridization Employing R (DECIPHER), com a ferramenta “Find Chimeras” (WRIGHT et al., 2012).

5.4.8 Análises filogenéticas

As árvores filogenéticas foram construídas no programa MEGA 5 (TAMURA et al., 2011). Para isso, as sequências obtidas neste estudo e outras, selecionadas no banco de dados públicos, foram alinhadas pela ferramenta Muscle. O algoritmo de distância evolutiva máxima verossimilhança com re-amostragem de 1000 foi aplicado usando o parâmetro Kimura-2.