O DNA metagenômico de solo e rizosfera de mandacaru durante o período chuvoso e de seca foi extraído utilizando-se o Power Soil™ DNA Isolation Kit (MoBio Laboratories, EUA) de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. A quantidade e a qualidade de DNA extraído foram verificadas em gel de agarose 1% (p/v). Após a eletroforese, o gel foi corado em solução de brometo de etídio (1,0 mg.mL-1) e fotografado.
4.2.1.3 Estrutura da comunidade bacteriana por meio da técnica de polimorfismo dos fragmentos terminais de restrição (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism
– T-RFLP)
4.2.1.3.1 Amplificação do gene 16S rRNA de Bacteria
O DNA metagenômico de cada amostra, obtida de solo e rizosfera de Cereus jamacaru, durante o período chuvoso e de seca, para os cindo pontos de coleta e três repetições (totalizando sessenta amostras), foi amplificado com os oligonucleotídeos iniciadores para o gene 16S rRNA 1492R (TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT) e 27F (AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG). Para a detecção de fluorescência na análise de T- RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism), a extremidade 5´ dos oligonucleotídeos iniciadores 27F foram marcadas com 6-carboxyfluorescein (FAM). A amplificação do fragmento do gene 16S rRNA de Bacteria de cada amostra foi feita em solução contendo 2,0 µl de tampão da enzima Dream Taq; 1,2 μL de MgCl2; 1,6 μL de dNTP
(2,5 mM); 0,07 μL de cada oligonucleotídeo iniciador a 5 ρmol; 0,2 μL de Dream Taq (Fermentas); 2 μL de DNA metagenômico de solo; água ultrapura (Milli-Q) autoclavada para um volume final de 20 μL. As reações de amplificação foram realizadas em termociclador (Applied Biosystems) segundo as condições: desnaturação inicial a 95°C por 5 minutos; 30 ciclos de 95°C por 30 segundos, 59°C por 45 segundos e 72°C por 1 minuto; extensão final de 10 minutos a 72°C. A qualidade da amplificação foi verificada em gel de agarose 1,5% (p/v). Após a eletroforese, o gel foi corado em solução de brometo de etídio (1,0 mg.mL-1) e fotografado.
Os produtos de PCR de Bacteria foram utilizados na reação de restrição com a endonuclease HhaI (GCG^C) (Fermentas). Para cada reação foram utilizados 2 μL de tampão (Buffer Tango(10X)); 1 μL da endonuclease de restrição HhaI 10U (Fermentas); 10 μL do produto de PCR e água ultrapura (Milli-Q) autoclavada para o volume final de 21 μL. As reações foram realizadas em termociclador (Applied Biosystems) a 37°C por 1h e 30 min, seguida de aumento da temperatura para 65°C durante 30 s.
4.2.1.3.3 Precipitação dos produtos da restrição
Após reação de restrição, os produtos digeridos foram precipitados para posterior análise dos fragmentos. Para a precipitação, foram adicionados a cada reação, 2 μL de EDTA (125 mM); 2 μL de acetato de sódio (3M) e 50 μL de álcool etílico (100%). A mistura foi agitada levemente por inversão por quatro vezes e incubada a temperatura ambiente por 15 minutos. As amostras foram centrifugadas por 30 minutos a 3000 g e o sobrenadante foi descartado. Foram adicionados 70 μL de álcool etílico (70%) em cada amostra e centrifugadas por 15 minutos a 1650 g. O sobrenadante foi descartado e as amostras foram secas até que não restasse nenhum vestígio de álcool etílico. As amostras foram armazenadas a -20°C até seu uso.
4.2.1.3.4 Análise e processamento dos dados de T-RFLP
A análise dos fragmentos terminais de restrição (T-RFs) foi realizada por meio de sequenciador automático ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Foram adicionados 2 μL de água ultrapura (Milli-Q) autoclavada em cada produto precipitado. Para o carregamento das amostras no sequenciador, 1 µl do produto precipitado foi ressuspendido em uma mistura contendo 8,7 μL de formamida HiDi e 0,3 μL de padrão de comprimento GeneScan™ - 600 LIZ™ Size Standard (Applied Biosystems). Antes do carregamento, as amostras foram desnaturadas por 3 min a 95°C e resfriadas a 0°C por 3 min.
Os dados obtidos no sequenciador foram analisados com o programa Gene Mapper v.4.1 (Applied Biosystems), sendo inspecionados visualmente para conferir a qualidade das corridas. Após esta etapa, os dados contendo as alturas dos picos foram transformados em uma matriz no programa Excel (Microsoft) onde foram organizados para posterior análise. Para os fragmentos terminais de restrição obtidos (T-RFs) de Bacteria, uma linha base limite de 50 unidades de fluorescência foi usada para discriminar os “picos verdadeiros” dos ruídos
de background provenientes da técnica, sendo considerados T-RFs maiores que 50 pares de base (pb) e menores que 800. As alturas dos picos (unidades de fluorescência) foram transformadas em dados relativos, onde os valores absolutos referentes à intensidade dos picos no eletroferograma e correspondentes aos comprimentos dos fragmentos foram apresentados na forma de valores percentuais de detecção. Essa transformação foi calculada dividindo cada valor de tamanho do pico pelo valor total dos picos de uma amostra. Isso é análogo em transformar cada altura de pico em dados de porcentagem em relação ao total de valores de altura de pico em uma amostra (CULMAN ET AL., 2008).
Os perfis de T-RFLP foram comparados entre as diferentes amostras, calculando a abundância relativa das T-RFS, onde cada T-RF foi considerada como uma Unidade Taxonômica Operacional (UTO) diferente. Foram consideradas T-RFs com fluorescência relativa >1% (LEHOURS et al., 2005) descartando-se os outros valores. Estes dados foram utilizados para elaboração dos histogramas e diagramas de Venn. Estes últimos foram confeccionados por meio de uma ferramenta interativa denominada VENNY (OLIVEROS, 2007).
Para as análises multivariadas, foram elaboradas matrizes com os dados de altura dos picos (amostras) e com os dados de análise de solo (variáveis ambientais). Com esse conjunto de dados, foi primeiramente realizada uma análise de correspondência (Detrended Correspondence Analysis – DCA) para verificar o comprimento do gradiente e decidir qual análise usar: Análise de Componentes Principais (Principal Component Analysis – PCA) ou Análise Canônica (Canonical Analysis – CA) (sem as variáveis ambientais) e Análise de Redundância (Redundancy Analysis – RDA) ou Análise de Correspondência Canônica (Canonical Correspondence Analysis – CCA) (com as variáveis ambientais) utilizando o programa Canoco 4.5 (TER BRAAK; SMILAUER, 2002). Foi aplicada análise de RDA, com teste de significância realizado pelo teste de permutação não-paramétrico de Monte Carlo com 499 permutações, oferecendo informações suplementares sobre os efeitos das variáveis ambientais, quantificando a variância explicada por cada fator independentemente (lambda) (DIAS et al., 2011). Foi feito o teste de SIMPER (Similarity Percentage) para pesar a contribuição de cada T-RF na similaridade/dissimilaridade entre as amostras (MESEL et al., 2004). As T-RFs que foram consideradas como as principais responsáveis pelas diferenças, foram denominadas de T-RFs SIMPER50, cuja contribuição cumulativa foi de 50% (VAJNA
et al., 2012). Foi realizada análise de similaridade (ANOSIM) que utiliza a matriz de Bray- Curtis para calcular um valor de R que pode variar de -1 a 1. Valores próximos de 0 indicam hipótese nula de diferença entre os grupos e valores maiores que 1 indicam discriminação
entre os grupos (BENNETT; KASEL; TIBBITS, 2008). Juntamente com ANOSIM foram elaborados gráficos de Non-metric Multidimensional Scaling (NMDS) que indicam a similaridade relativa das amostras por meio da distância de ordenação, onde amostras bem similares encontram-se bem próximas (BENNETT; KASEL; TIBBITS, 2008). Também foi efetuado o teste de Mantel na tentativa de compreender as relações entre os atributos do solo e os dados obtidos por T-RFLP. A partir de uma matriz com os dados de abundância de T-RFs obtidos pela análise de T-RFLP, foi calculado o índice de diversidade de Shannon (H´) para cada amostra a partir da média das triplicatas de cada uma. As análises descritas acima foram realizadas com os programas Primer 6.1.6 (CLARKE; GORLEY, 2006) e Past 2.12 (HAMMER; HARPER; RYAN, 2001).
4.2.1.4 Análise da comunidade bacteriana por meio do sequenciamento parcial do gene