Deformasjoner

Muitos procedimentos de marcação de proteínas e até mesmo células vivas íntegras com 99mTc já foram padronizados, utilizando metodologias rápidas e eficientes. O 99mTc é um radionuclídeo com energia de radiação relativamente baixa (140 Kiloelétron-voltz). Um radiotraçador é um radioisótopo introduzido em determinado meio a se estudar para seguir o caminho que ele percorre no dado sistema, através da detecção da radiação por ele emitida (Rocha e cols., 1971).

Segundo a metodologia proposta por Alves (2002), a LMA 0,2M foi marcada adequadamente com o 99mTc, utilizando uma combinação de dois agentes redutores cloreto estanoso e boridreto de sódio. Desta forma obteve-se um teor de pureza radioquimica de 88%. Isto significa que 88% dos átomos de tecnécio adicionados em reação se ligaram a molécula de LMA. Portanto, apenas 12% de impureza foram encontrados devido ao tecnécio livre que não se incorporou e ao tecnécio hidrolisado. Este padrão de marcação está de acordo com aquele estipulado pela Farmacopéia Norte-Americana para radiofármacos. Desta forma, o produto marcado (99mTc-LMA) poderia ser utilizado para estudos de biodistribuição.

Quando se marca uma estrutura torna-se necessário assegurar que suas propriedades quimica e biológica não foram alteradas pela presença do átomo radioativo na molécula. Assim, estudos de bioatividade foram realizados utilizando hemácias A1 para testar a atividade hemaglutinante da 99mTc-LMA. Os resultados

mostraram que não houve diferença significativa entre os ensaios realizados com a LMA e a 99mTc-LMA.

Os ensaios realizados em diferentes tempos demonstraram que as radioatividades medidas foram predominantes nos rins e na urina (bexiga) dos animais injetados com 99mTc-LMA 0,2 M pela via caudal. Essa predominância se instituiu desde os primeiros 5 minutos e prevaleceu até os 180 minutos. De acordo com a fig. 26, observa-se que o sangue e o fígado apresentam perfis de eliminação semelhantes; o cérebro, estômago, baço, pulmão e coração mostraram perfis de eliminação similares ao sangue, no entanto com decréscimos suaves. Essa semelhança sugere que a radiação medida nesses órgãos é decorrente da perfusão sanguínea, sem que haja evento de ligação específica da 99mTc-LMA 0,2 M. As radiações máximas alcançadas nesses órgãos foram observadas nos primeiros 10 minutos após a injeção da LMA marcada, com decréscimos suaves até os 180 minutos.

Proteínas do tamanho da albumina (69KDa) não passam facilmente pelos glomérulos renais, no entanto, solutos com massa molecular abaixo de 5 KDa possuem livre trânsito através da membrana filtrante do glomérulo. As macromoléculas de 17 KDa são filtradas com certa dificuldade, de acordo com sua carga ou forma (Aires, 1991). Assim, a 99mTc-LMA 0,2 M (120KDa) não poderia passar livremente na membrana filtrante do glomérulo. Portanto, a verificação da elevada radioatividade na urina (com massa superior a 5KDa, de acordo com a fig. 26) pode ser devido a frações menores da 99mTc-LMA 0,2 M metabolizadas in vivo. No entanto, se a lectina poderia estar sendo eliminada de forma intacta se a mesma pudesse estar ativando mecanismos de endo e exocitose nas células glomerulares através do reconhecimento glicídico.

A radioatividade nos rins é prevalente e permanece razoavelmente constante após 180 minutos decorridos da biodistribuição. Supondo que os rins estejam filtrando a 99mTc-LMA 0,2M; é improvável que após 180 minutos ainda exista proteína marcada a ser filtrada, uma vez que nesse tempo de biodistribuição o sangue já não apresenta radioatividade tão significativa como a dos rins. Assim é provável que esteja ocorrendo uma ligação da 99m_{Tc-LMA 0,2 M no tecido renal. As células parietais do}

ramo ascendente da alça de Henle produzem e excretam normalmente na urina uma glicoproteína denominada Proteína de Tam-Horsfall (PTH). Essa proteína possui cerca

de 30% em massa de glicídeos e dentre eles encontramos a 2-NacGal como parte desses carboidratos (Williams e cols., 1984; Cavallone e cols., 2001). A 2-NacGal presente na PTH é componente do antígeno Sda, um antígeno de elevada afinidade pela DBL (esse glicídeo é um tetrassacáride muito semelhante à estrutura mostrada no apêndice IV). Portanto, a presença da PTH nas células renais e na urina pode estar relacionada com a elevada radioatividade observada na urina, e principalmente nos rins dos animais injetados com 99mTc-LMA 0,2 M; uma vez que essa lectina pode estar ligando especificamente na PTH presente nas células renais. Se a 99mTc-LMA 0,2 M está alcançando as células renais produtoras de PTH, é possível que esta esteja sendo eliminada pela urina ligada na 99mTc-LMA 0,2 M, o que explicaria a elevada radioatividade na urina. A PTH é excretada de forma íntegra na urina e o mecanismo de excreção ainda é obscuro.

A autoradiografia dos rins de camundongos Swiss injetados com 125I-LMA 0,2 M demonstra que a radioatividade se concentra no córtex renal, onde se encontram os glomérulos renais em sua maior parte. Os dados obtidos com a biodistribuição utilizando a 99mTc-LMA 0,2 M corroboram com os resultados obtidos nas autoradiografias (fig.28). Assim é provável que estejam ocorrendo ligações específicas entre a LMA 0,2M e as células do tecido renal, e que a radiação detectada nos rins após 180 minutos da biodistribuição com 99mTc-LMA 0,2 M seja devido à lectina marcada ligada. Além da presença de radioatividade elevada nos rins após 180 minutos, a radioativiadade encontrada na urina foi em grande parte excluída em coluna de Sephadex G25, indicando que os elementos radioativos excluídos são maiores que 5KDa. Essa observação exclui a possibilidade de uma ligação inespecífica de átomos de 99mTc no tecido renal, provenientes de uma possível metabolização da 99mTc-LMA 0,2M em partículas menores. Nesse caso, a radioatividade da urina seria retida pela coluna de Sephadex G25 e seu volume de eluição seria maior que o volume vazio dessa coluna, o que não foi observado.

6. C

ONCLUSÕES

• Duas frações ativas da LMA foram purificadas do extrato salino de sementes da Macrotyloma axillare pela metodologia proposta. Grande parte da LMA ativa pôde ser isolada apenas pelas duas etapas iniciais de precipitação do extrato bruto (tratamento térmico e precipitação por etanol). As duas frações ativas 0,2 e 0,3M da LMA foram purificadas por uma etapa cromatográfica de troca iônica em Q-Sepharose pH 8,3.

• A metodologia de purificação proposta possibilitou o isolamento das frações 0,2M e 0,3M da LMA, com bons rendimentos.

• As duas frações das lectinas isoladas apresentaram diferenças dos ensaios de estabilidade térmica e na dependência de pH. Os resultados obtidos para a LMA 0,3M sugerem que essa fração é mais resistente termicamente e mantém sua atividade total numa faixa maior de pH, comparando com a fração 0,2M. • As frações de lectinas isoladas, assim como a maioria das lectinas de

leguminosas, mostraram-se dependentes dos íons Cálcio(II) e Manganês(II) para a manutenção da atividade máxima.

• A massa molecular dos monômeros de ambas as isoformas foi determinada em eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS a 12% como sendo de 29 KDa. As determinações da massa molecular da proteína nativa das frações da LMA purificadas mostraram massas moleculares indicativas de tetrâmeros (90- 120KDa) em pH 8,5 e massas moleculares condizentes com dímeros (40- 50KDa) em pH 5,0 e 7,0.

• As frações ativas 0,2 e 0,3M da LMA apresentam especificidades para hemácias nativas do subgrupo A1. O estudo com hemácias tratadas com

tripsina demonstrou que a fração 0,2M preserva sua especificidade pelo grupo sanguíneo A (A1, A2), enquanto que a LMA 0,3M perde sua especificidade,

sendo positiva para as hemácias A1, A2, B e O.

• Os ensaios de aglutinação com cepas isoladas de Escherichia coli demonstraram que o resíduo 2-NacGal é relativamente raro na população analisada (cerca de 8% de aglutinação positiva). Os resultados mostraram que os padrões de cepas semelhantes quanto a produção de toxinas termoestáveis

de procedências diferentes (padrões de Escherichia coli ST Ufop e Unicamp), podem conter diferenças na constituição glicídica, pois somente um dos padrões foi positivo (E. coli ST Ufop).

• Os ensaios de biodistribuição demonstraram que a radioatividade da 99mTc- LMA 0,2M se concentra nos rins e na urina em 5 minutos de distribuição e permanece predominante até 180 minutos nos rins e também na urina. A predominância de grande parte da radioatividade nos rins pode indicar que existe ligação da 99mTc-LMA 0,2M no tecido renal, com eliminação da mesma pela urina. As auto-radiografias de camundongos injetados com 125I-LMA 0,2M demonstraram radioatividade na região do córtex renal, o que apóia a hipótese de estar havendo ligação da lectina nas células renais. Essa ligação específica pode representar a descoberta de uma ferramenta para estudos de fisiologia renal.

7. R

EFERÊNCIAS

B

IBLIOGRÁFICAS

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A

PÊNDICE

I

Dados da reta-padrão de dosagem de proteínas pelo método de Lowry:

Vol.(µl) [BSA]µg/ml A660 (n=3) Média A660

5 20 0,035/0,034/0,034 0,034

10 40 0,067/0,066/0,066 0,066

15 60 0,099/0,103/0,105 0,102

20 80 0,140/0,134/0,132 0,135

25 100 0,161/0,165/0,172 0,166

Tabela 8 - Pontos da reta padrão utilizados para a dosagem de proteínas.

y = 0,0017x + 0,0012 R2 = 0,9958 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 0,18 0,2 0 25 50 75 100 [BSA] microgramas/ml A 66 0

Figura 30 - Reta padrão de dosagem de proteínas pelo método de Lowry.

A reta padrão foi construída a partir da média da triplicata de cada ponto considerado. Os volumes foram tomados de uma solução de Soroalbumina Bovina a 1mg/ml

A

PÊNDICE

II

Reta-padrão das determinações de massa molecular em Sephacryl HR S200

y = -0,0751x + 6,9106 R2 = 0,992 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 VOLUMES DE ELUIÇÃO (ml) L O G M M A B C D E F

Figura 31 – Reta padrão das cromatografias de exclusão molecular.

Padrões MM LogMM Vol. Eluição (ml) A – Dextrano Azul >>300.000 5,48 19,37 B - Desidrogenase Alcoólica 150.000 5,18 24,00 C - Hemoglobina 64.000 4,80 27,14 D - Lectina da Erthryna especiosa 58.000 4,76 28,51 E - Tripsina 24.000 4,38 32,86 F - CoCl2 <<5.000 3,70 43,37

Tabela 9 – Volumes de eluição obtidos dos padrões de massa molecular.

A

PÊNDICE

III

Figura 32 - Estrutura química sintética do melhor ligante glicídico da DBL (derivado do Tetrassacáride determinante do antígeno Sda. Modificado de Blanco e cols.(2001).

In document Miljøvennlige vegdekker : sluttrapport forsøksstrekninger (sider 28-37)