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As cepas T. rubrum ATCC 1683 e T mentagrophytes LM02 foram cultivadas em ASD na presença e ausência do óleo essencial de C. winterianus nas concentrações 78, 156 e 312 µg/mL, com base na técnica de microcultivo em lâmina. Esta técnica de cultivo em lâminas permite demonstrar no microscópio óptico comum a morfologia dos fungos e suas alterações provocadas pelo produto nas referidas

concentrações. Essas alterações morfológicas foram analisadas por microscopia óptica, em um aumento de 400x, como pode ser visto nas figuras 18 e 19 referentes às cepas T. rubrum e T mentagrophytes, respectivamente.

O exame microscópico do experimento controle demonstrou estruturas características de cada espécie, com estrutura celular uniforme, citoplasma homogêneo, ausência de clamidoconídios e grande esporulação por parte de ambas as cepas. A espécie T. rubrum mostrou longas hifas hialinas, estreitas e septadas, com seus conídios tipicamente em forma de gota ou lágrima, lateralmente dispostos nos conidióforos e não foi observada a presença de macroconídios, como ilustra a figura 18 (A). A ausência de macroconídios não descaracteriza a espécie, pois as cepas podem ou não apresentá-los.

T. rubrum cultivado em meio de cultura acrescido do óleo essencial apresentou diversas alterações morfológicas. Essas alterações foram semelhantes em todas as concentrações, porém, apresentando um comportamento crescente no tocante à incidência dessas alterações na medida em que a concentração do óleo essencial foi aumentada (figura 18 B, C).Embora a forma dos conídios de T. rubrum não tenha sido alterada, a sua produção foi seriamente prejudicada em todas as concentrações do óleo essencial, tornando-se raramente encontrados na concentração de 312 µg/mL do óleo no meio de cultura. A grande maioria das hifas apresentou-se muitas vezes curtas, mais largas do que o normal, um pouco descoradas e com vacúolos no seu interior. Não foram observados macroconídios.

A partir da concentração de 156 µg/mL, foi detectada a presença de clamidoconídios que teve a sua produção aumentada na proporção que se aumentava a concentração do óleo essencial. Os clamidoconídios, também chamados de hipnosporos, formam-se à custa dos filamentos micelianos, podendo ser terminais ou intercalares, isolados ou contínuos. São conídios de desenvolvimento tálico e de origem holoblástica, uma vez que todas as paredes celulares estão envolvidas ativamente na formação do conídio (LACAZ et al., 1998).

Os clamidoconídios são geralmente arredondados, de volume aumentado e com paredes espessas. São formados em condições ambientais adversas, não favoráveis ao desenvolvimento fúngico (GOMPERTZ, et al., 2000). Talvez seja seja esta razão que foram produzidos na medida em que se aumentava a concentração do óleo essencial, na tentativa de suportar seu crescimento na presença desse componente adverso..

FIGURA 18. Micromorfologia de T. rubrum ATCC 1683 cultivado na ausência e presença do óleo essencial de C. winterianus. Experimento controle apresentando formas típicas da espécie (A); crescimento na presença do óleo essencial (156 µg/mL) apresentando hifas curtas, tortuosas (B); e clamidoconídios (C). Barra = 50 µm (400x).

A

Com relação ao T. mentagrophytes, foram também observadas hifas longas, hialinas, estreitas e septadas. Os microconídios arredondados e agrupados em forma de cachos agregados aos conidióforos. Alguns macroconídios foram visualizados, embora que eles também podem estar ausentes; esses são morfologicamente semelhantes a charutos e de parede fina, conforme a figura 19 (A, B).

T. mentagrophytes cultivado em meio de cultura acrescido do óleo essencial também apresentou diversas alterações morfológicas. E da mesma forma de T. rubrum, as alterações foram semelhantes em todas as concentrações e se agravaram na medida em que se aumentava a concentração do óleo essencial, prejudicando a morfogênese normal da espécie (figura 18 C, D).

A forma dos conídios de T. mentagrophytes não foi alterada, mas o seu agrupamento típico da espécie foi fortemente prejudicado, tornando-se bastante dispersos em todas as concentrações do óleo essencial. As hifas apresentaram-se muito mais largas do que o normal, com grande perda de pigmentação e com vacúolos abundantemente distribuídos no seu interior. Não foram observados macroconídios e raros clamidoconídios foram encontrados nas primeiras concentrações do óleo essencial, aumentando sua produção na concentração de 312 µg/mL.

Em suma, essas alterações morfológicas observadas no microcultivo de ambas as cepas prejudicaram até mesmo a caracterização normal da espécie em estudo, segundo os critérios micromorfológicos.

A morfologia fúngica é um fator de grande importância durante a invasão e durante a evasão das células do hospedeiro. A forma celular (conídios) parece iniciar a infecção, mas as hifas apresentam alguma vantagem em específicos estágios do processo infeccioso. As hifas formadas são mais difíceis de serem fagocitadas e podem eventualmente provocar morte de macrófagos, penetrar mais facilmente através do epitélio, invadindo tecidos (ROMÁN et al, 2007). Por isso, as alterações na morfologia de fungos filamentosos por compostos antifúngicos são de grande importância para o impedimento do seu crescimento normal, a viabilidade e a virulência dos fungos.

FIGURA 19. Micromorfologia de T. mentagrophytes LM02 cultivado na ausência e presença do óleo essencial de C. winterianus. Experimento controle apresentando formas típicas da espécie com macroconídios charutóides com poucos septos (A) e microconídios esféricos e agrupados ao longo dos conidióforos (B); crescimento na presença do óleo essencial (156 µg/mL) apresentando conídios em pouca quantidade e desagrupados, e hifas largas com vacúolos no interior. Barra = 50 µm (400x).

A B

Alguns autores afirmam que células tratadas com drogas que interferem com a parede celular frequentemente apresentam distintas características morfológicas (GUNJI et al., 1983; FUKUSHIMA et al., 1993). Ainda, é relatado que as modificações anormais na estrutura morfológica da célula fúngica causadas por óleos essenciais podem estar relacionadas com a interferência dos seus constituintes sobre enzimas responsáveis pela biossíntese ou manutenção da parede celular, afetando o crescimento e morfogênese fúngica (ZAMBONELLI et al., 1996; DEBILLBECK et al. 2001).

5.8 EFEITO DO ÓLEO ESSENCIAL SOBRE A MACROMORFOLOGIA DOS