Bioadesão pode ser definida como o estado em que dois materiais, pelo menos um de natureza biológica, são mantidos juntos por um período de tempo prolongado, através de forças interfaciais (REPKA et al., 2000).
A principal vantagem da utilização de sistemas bioadesivos como veículos de fármacos é prolongar o tempo de permanência do fármaco no local de aplicação, o que permite um contato intensificado da formulação com a barreira biológica, diminuindo a frequência da aplicação do produto e, desse modo, aumentando a aderência do paciente à terapia. (SMART et al., 2003)
As forças necessárias para remover as formulações analisadas a partir da superfície do dente bovino estão descritas na Tabela 8.
Primeiramente, constata-se que a adição dos polímeros na fase aquosa dos sistemas aumentou significativamente a força bioadesiva em relação aos sistemas formados apenas com água no sistema. Além disso, o aumento da fase aquosa no sistema também aumentou significativamente a bioadesão das formulações, devido à formação de cristais líquidos. A maior bioadesão dos sistemas líquido-cristalinos pode ser explicada por suas propriedades reológicas, ou seja, o aumento da sua viscosidade e sua característica elástica contribui com o aumento do tempo de permanência da formulação na membrana empregada no teste.
Tabela 8 – Trabalho da força bioadesiva (mN.s) das formulações. Os valores representam a
média ± desvio padrão, à temperatura de 37ºC.
Sistemas Trabalho da força
Bioadesiva (mN.s) F1-A 18,75 ± 0,80 F2-A 11,07 ± 0,67 F3-A 13,91 ± 0,77 C974P 0,5% 90,08 ± 1,20 F1-C 26,29 ± 3,15 F2-C 12,84 ± 2,14 F3-C 11,23 ± 0,70 PP 0,5% 141,4 ± 2,40 F1-P 24,35 ± 3,20 F2-P 9,53 ± 2,00 F3-P 4,75 ± 2,20 F1- QS 165,2 ± 6,56 F2- QS 95,17 ± 1,97 F3- QS 85,58 ± 2,16
Os sistemas contendo dispersão de QS 0,5% na fase aquosa apresentaram os maiores valores de bioadesão. Bocataj e colaboradores (2003) também relataram em seu estudo que a quitosana apresentou maior bioadesão que os polímeros de Carbopol® e Policarbofil®. A quitosana é descrita como um polímero catiônico, e tem uma excelente propriedade bioadesiva devido à capacidade de aumentar as forças de atração molecular por interações
Resultados e discussão
eletrostáticas com a saliva, devido à presença de grupos aminos positivos em sua cadeia e pela presença do ácido siálico carregado negativamente na saliva, que recobre toda a superfície bucal (PARK et al., 2012).
Os valores de bioadesão de F1-P e F1-C não demonstraram diferença significativa. Isso pode ser devido a ambos serem derivados do ácido poliacrílico. Polímeros sintéticos derivados do ácido poliacrílico são carregados negativamente, mas também são bioadesivos. Neste caso, os resultados da mucoadesão são devido aos processos físico-químicos, tais como as interações hidrofóbicas, ligações de hidrogénio e de van der Waals, que são controladas pelo pH e composição iónica (WOODLEY et al., 2001). Além disso, suas cadeias são flexíveis o suficiente para se interdifundirem na camada de muco e penetrar o suficiente até formar uma rede. A maior parte dos derivados de ácido poliacrílico não é solúvel em água, mas formam géis viscosos quando hidratados (CARVALHO et al., 2008), aumentando a capacidade de se aderir à superfície do dente.
Portanto, para a bioadesão ocorrer, deve acontecer um íntimo contato entre o substrato e o polímero como resultado de um bom umedecimento da superfície bucal com saliva.
Assim, a intensidade da adesão é influenciada principalmente pela capacidade de interação dos polímeros. Se a capacidade de interação de polímero for demasiado elevada, a película formada pode ser muito bioadesiva, e a sua remoção do substrato biológico pode ser muito difícil, podendo levar à danificação do epitélio bucal. Além disso, a secreção contínua de saliva conduz à diluição subsequente do fármaco, e um longo tempo de adesão pode levar à degradação enzimática do fármaco. Assim, o nível elevado de bioadesão dos polímeros pode não ser útil para sistemas de liberação bucal para fins práticos (PARK et al., 2012).
Não existe uma fórmula padrão disponível para sistemas de liberação bioadesivos para aplicação bucal. No entanto, o sistema de liberação formado pelo polímero Carbopol® em sua fase aquosa demonstrou ser adequado por apresentar um elevado grau de bioadesão e a possibilidade de remoção sem agredir o ambiente bucal.
As formulações contendo Carbopol® em sua fase aquosa, F1-C, F2-C e F3-C, foram escolhidas para a incorporação o peptídeo p1025 por apresentar características físico-químicas adequadas ao objetivo proposto, entre elas, a capacidade de formação de mesofases líquido- cristalinas estruturadas com o aumento de fase aquosa. Ademais, essas formulações apresentaram características reológicas, mecânicas e bioadesivas compatíveis para administração bucal, pois demonstraram maior retenção dos sistemas no ambiente bucal com o aumento da sua elasticidade e adesividade. Tal comportamento pode aumentar a performance clínica da formulação desenvolvida.
5.6 Caracterização físico-química das formulações contendo peptídeo p1025
Após a incorporação do peptídeo p 1025 nas formulações selecionadas, os sistemas F1-CP, F2-CP e F3-CP foram caracterizados por MLP, SAXS, análises térmicas, análise de perfil de textura e pela avaliação in vitro da força bioadesiva em superfície de dente bovino.
As fotomicrografias das formulações F1-CP, F2-CP e F3-CP estão na Figura 31. Na fotomicrografia de F1-CP observa-se a presença de estrias e cruz de malta o que demonstra ter característica tanto de fase hexagonal quanto de fase lamelar. Já F2-CP e F3-CP demonstrou ter comportamento isotrópico microemulsionado.
(a) (b)
(c)
Figura 31– Fotomicrografias das formulações F1-CP (a), F2-CP (b) e F3-CP (c).
A Figura 32 mostra que ocorreu diminuição significativa no grau de organização do sistema, demonstrado por picos mais largos (MANAIA, 2012). Isto pode ser resultado da incorporação de peptídeo p1025 entre as estruturas cilíndricas promovendo um aumento da distância entre elas.
Resultados e discussão
Figura 32- Avaliação estrutural das formulações F1-CP, F2-CP e F3-CP por SAXS.
Pela Tabela 9, foi observado também um comportamento líquido cristalino hexagonal para formulação F1-CP, demonstrando ser um sistema mais estruturado. Isto vem confirmar a ideia que os sistemas microemulsionados são sistemas complexos e necessitam de mais de uma técnica para caracterizar suas estruturas.
Tabela 9 - Valores de qmax (Å) e razão entre as distâncias interplanares para as formulações
F1-CP, F2-CP e F3-CP.
Formulação qmax1 qmax2 qmax3 d2/d1 d3/d1 Estrutura
F1-CP 0,78 1,59 2,36 2 3 Hexagonal
F2-CP 0,81 1,54 - 2 - Lamelar
F3-CP 0,82 - - - 3 Microemulsão
Dessa forma, a incorporação do peptídeo p1025 não demonstrou alterar a estrutura dos sistemas quando comparados com os sistemas sem peptídeo.
As curvas termogravimétricas das formulações FI-CP, F2-CP e F3-CP estão ilustradas na Figura 33. As formulações demonstraram o mesmo perfil de perda de massa que as formulações sem peptídeo. Sendo assim, foi analisada a perda de massa nas diferentes faixas de temperatura a fim de confirmar se a verificar a porcentagem de perda de água.
Figura 33 - Curvas termogravimétricas das formulações FI-CP, F2-CP e F3-CP.
A Tabela 10 mostrou que a formulação F1-CP teve a maior perda de água, com 30% de perda total, já a formulação F2-CP veio em seguida com 26% de perda de água e, por último, a formulação F3-CP com apenas 7,89%. Tais dados confirmam que a formulação F1- CP apresenta maior quantidade de fase aquosa. Além disso, os dados demonstraram que não houve diferença na força intermolecular da água.
Tabela 10 - Perda total e parcial de massa (%) nos intervalos de temperatura para as
formulações FI-CP, F2-CP e F3-CP.
20-50ºC 50-70 ºC 70-100ºC Perda Total
F1-CP 7,00 13,00 10,26 30,26
F2-CP 7,00 9,00 10,00 26,0
F3-CP 0,4 3,02 4,47 7,89
As curvas obtidas no ensaio de DSC das formulações com peptídeo F1-CP, F2-CP e F3-CP então na Figura 34.
Deslocamentos de picos e diferenças na sua intensidade e formato indicam que ocorre algum tipo de interação físico-química entre formulação e o peptídeo. Essas interações são necessárias para que ocorra algum tipo de retenção do fármaco nas estruturas líquido- cristalinas e, consequentemente, um aumento no tempo de liberação do mesmo (ROSSANEZI, 2008). 0 20 40 60 80 100 Perda de massa ( % ) 0 100 200 300 400 500 600 Temperatura (°C) F1- CP ––––––– F2- CP – – – – F3- CP ––––– · Universal V4.1D TA Instruments
Resultados e discussão
(a) (b)
(c)
Figura 34 – Comparação das curvas de DSC entre as formulações (a) F1-C e F1-CP, (b) F2-C
e F2-CP, (c) F3-C e F3-CP.
A análise de perfil de textura também foi realizada na formulação com a presença de peptídeo p1025 a fim de se observar se houve alterações nas propriedades mecânicas das formulações. Na Tabela 11, pode-se observar que a incorporação do peptídeo diminuiu significativamente os parâmetros dureza, compressibilidade e adesividade, enquanto que a coesão não sofreu alteração significativa.
Esses resultados demonstraram que as formulações sofreram uma desestruturação, diminuindo o grau de organização das moléculas. Esses resultados estão de acordo com os resultados relatados pela curva de SAXS, que demonstrou que apesar de possuírem estruturas líquido-cristalinas, o fator de estrutura das formulações com o peptídeo foi menor.
-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 Fluxo de calor (W/g) -60 -40 -20 0 20 40 Temperatura (°C) F1- C F1- CP
Exo Up Universal V4.1D TA Instruments -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 Fluxo de Calor(W/g) -60 -40 -20 0 20 40 Temperatura (°C) F2- PC F2- C
Exo Up Universal V4.1D TA Instruments
-1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 Fluxo de calor (W/g) -60 -40 -20 0 20 40 Temperatura (°C) F3- CP F3- C
Tabela 11. Propriedades mecânicas da formulação F1-C e F1-CP determinadas através da
análise de perfil de textura. Cada valor representa a média ± desvio padrão, à temperatura de 37º C.
Formulação Dureza (mN) Compressibilidade (mN.s) Adesividade (mN.s) Coesão F1-C 46,0 ± 1,00 541,7 ± 6,40 283,7 ± 32,0 0,7786 ± 0,0633 F1-CP 35,6 ± 0,5 444,0 ± 1,00 216,33 ± 16,1 0,7786 ± 0,0633
A Tabela 12 mostra os valores do ensaio de bioadesão in vitro das formulações com a presença do peptídeo p 1025. Nota-se que os valores do trabalho da força bioadesiva foram significativamente maiores em todas as formulações. Isso demonstra a importância de se realizar testes que simulem o ambiente bucal para se caracterizar mais fielmente as formulações.
Tabela 12 – Trabalho da força bioadesiva das formulações F1-CP, F2-CP e F3-CP. Os
valores representam a média ± desvio padrão, à temperatura de 37ºC.
Sistemas Força Bioadesiva (mN.s)
F1-C 26,29 ± 3,15 F2-C 12,84 ± 2,14 F3-C 11,23 ± 0,70 F1-CP 55,95 ± 0,80 F2-CP 29,76 ± 0,50 F3-CP 15,72 ± 0,35
Esses resultados obtidos sugerem que a presença de p1025 aumentou a interação da formulação com o substrato biológico, aumentando desse modo o tempo de retenção da formulação no ambiente bucal, consequentemente, aumentando a eficácia do fármaco.
Isso se deve ao p1025 ter afinidade pela saliva, uma vez que esse peptídeo é análogo à adesina da parede do S. mutans. Ensaios in vitro de atividade de adesão de S. mutans ao dente identificaram que a glicoproteína 440 kDa presente na saliva é o receptor do antígeno SA (I/II) e, portanto, medeia a ligação entre esse antígeno e a saliva (CARLÉN, 1995). Este
Resultados e discussão
mediador, conhecido como aglutinina salivar, compreende a glicoproteína 440 kDa e componentes de baixo peso molecular (YOUNSON et al., 2004).
Portanto, a incorporação do peptídeo melhorou as características estruturais e mecânicas da formulação.
5.7 Avaliação da cinética de liberação in vitro do peptídeo p1025 5.7.1 Parâmetros analíticos
A Figura 35 apresenta o gráfico da curva analítica com a equação da reta e coeficiente de correlação (R2). A curva apresentou-se linear e com valor de R2 dentro do requerido pela ANVISA (mínimo 0,99) (BRASIL, 2003).
Figura 35 - Curva analítica do p1025, equação da reta (y) e o respectivo coeficiente de
correlação (R2).
5.7.2 Ensaio de liberação in vitro
O ensaio de liberação in vitro foi realizado para a formulação F1-CP e para a solução
de peptídeo p1025 na concentração de 1000 Pg/mL.
No ensaio de liberação realizado com a membrana sintética, não foi possível a quantificação do peptídeo p1025 liberado da F1-CP pelo HPLC em nenhum tempo de coleta.
y = 13533x - 3416 R2 = 0,9986 0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 0 5 10 15 20 Ár ea do pico (m V/s )
Já no ensaio de liberação com a solução do peptídeo na concentração de 1000 Pg/mL, foi quantificado 0,04% do peptídeo nas primeiras 12 horas e 0,05% de peptídeo em 24 horas.
Posteriormente, no ensaio de liberação realizado sem a membrana sintética, demonstrou-se que a formulação F1-CP foi capaz de liberar 4,14% do peptídeo nas primeiras 12 horas e 4,61% do peptídeo em 24 horas.
Dados da literatura, como o observado por Hu e colaboradores (2004), em um ensaio de liberação, também mostraram uma liberação em torno de 4,0% de um hormônio peptídico encapsulado em nanopartículas, em 24 horas.
Dessa forma, esses resultados sugerem a possibilidade de que a membrana sintética, empregada na realização do primeiro ensaio, esteja impedindo a liberação do peptídeo para o meio receptor, impossibilitando a análise quantitativa do peptídeo pelo CLAE. Isso pode ser em virtude de que o poro da membrana sintética utilizada ser menor do que o tamanho do peptídeo, que apresenta uma elevada massa molecular (2202,5 g/mol).
5.8 Testes de avaliação antimicrobiana
A análise microbiológica foi feita com o objetivo de se investigar a ação antimicrobiana do peptídeo sintetizado p1025 e sua ação sobre o biofilme de S. mutans quando incorporado ao sistema de liberação. O sistema escolhido para os ensaios foi o F3-C devido a sua baixa viscosidade e, desse modo, melhor adaptação para a metodologia aplicada.
5.8.1 Concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima