A avaliação da atividade antimicrobiana foi realizada com adaptações do protocolo de ensaio de inibição de crescimento por microdiluição em caldo, segundo National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) (NCCLS, 2002; 2003), a ser descrito abaixo. A determinação da concentração inibitória mínima in vitro dos peptídeos e do Ca(OH)2 foi analisada em
bioensaios contra a bactéria E. faecalis (ATCC 29212) e o fungo C. albicans (ATCC 10231).
5.4.1. Bioensaios antífúngicos
O fungo C. albicans (ATCC 10231) também foi submetido a análise de suas fases de crescimento previamente a realização dos experimentos para avaliação da atividade antimicrobiana das amostras. As curvas de crescimento deste fungo foram realizada a partir de uma colônia pré-inoculada e incubada durante 18 h, em 5 mL de meio RPMI-1640 (Sigma Chemicals Co., EUA) com solução tampão MOPS [ácido 3-(N-morfolino) propanosulfônico] a 0,165 mol.L- 1, a 30 oC, 200 rpm. Após esse período, as células foram contadas em câmara
de Neubauer (densidade 1x104 UFC.mL-1) e um novo inóculo foi realizado com
uma concentração de 2,5x103 UFC.mL-1, no volume de 5 mL, incubado a 30 oC,
células totais (por densidade óptica) e viáveis (por contagem do número de UFC.mL-1, em meio sabouraud ágar dextrose (Difco, EUA)) da suspensão fúngica. A D.O. foi analisada por leitura em leitor de microplacas (Bio-Tek PowerWave HT, EUA), a 595 nm, com alíquotas de 100 µL da suspensão. A inoculação em meio sólido realizada a cada 4 h pela técnica de microgota, no qual 100 µL da suspensão foi submetido a 10 microdiluições seriadas (1:10) em solução salina (0,85% NaCl) e Tween 20 (0,2%) estéril. A partir das microdiluições, 3 microgotas (2 µL) de cada diluição foram inoculadas em meio sólido. As placas foram incubadas de 24 h a 48 h, à 37 oC, para contagem de
unidades formadoras de colônias (células viáveis). O crescimento de C.
albicans foi analisado até o período em que a D.O. foi estabilizada. Por fim,
foram correlacionados os valores de D.O. e UFC, de acordo com cada 4 h das curvas de crescimento.
Após determinação da fase logarítmica das curvas de crescimento, o fungo foi pré-inoculado a partir de uma colônia em 5 mL de meio RPMI-1680 com MOPS e incubado até que alcançasse a absorbância de 0,16 – 0,18, a 595 nm. Ao alcançar esta absorbância, as células foram novamente contadas em câmara de Neubauer para obtenção da concentração para os bioensaios. Os bioensaios antifúngicos foram realizados em meio RPMI-1680 com MOPS com a concentração de 2,5x103 UFC.mL-1 em poços com um intervalo de concentrações das amostras a serem testadas. Os intervalos das concentrações testadas para determinação de uma concentração inibitória mínima ou percentual de inibição de crescimento microbiano foram de 128 a 1024 µg.mL-1 para os peptídeos (clavaninas A e X e LL-37) e para Ca(OH)
2. Os
controles do bioensaio antifúngico foram: (1) células fúngicas e meio de cultura (100% de crescimento bacteriano); (2) células fúngicas, anfotericina B na concentração de 10 µg.mL-1 e meio de cultura (100% de inibição do
crescimento fúngico); e (3) meio de cultura sem fungo e sem amostras (branco).
Os grupos foram montados em duplicata biológica e triplicata técnica em placas de cultura de 96 poços (TPP, EUA) incubada por 48 h, a 30 oC, sob agitação média em leitor de microplacas (Bio-Tek PowerWave HT, EUA), com leituras a cada 4 h, a 595 nm. Em virtude de algumas amostras testadas não alcançarem 100% de inibição do crescimento bacteriano, foram estimadas as
porcentagens de inibição a partir das concentrações testadas. A CIM ou percentual de inibição de crescimento foram determinados a partir dos crescimento microbiano nos pontos da metade da fase logarítmica das curvas de crescimento realizadas previamente (abs 0,16 – 0,18), comparados aos controles positivo e negativo. A CIM, portanto, foi determinada como a menor concentração das amostras capaz de inibir 100% do crescimento bacteriano, não apresentando diferente estatística em relação ao controle negativo. Todas as concentrações das amostras testadas foram inoculadas por microgota em meio sólido para confirmação de atividade fungicida ou fungistática.
5.4.2. Bioensaios antibacterianos
Previamente a realização dos experimentos para avaliação da atividade antimicrobiana das amostras, foi determinado o comportamento da bactéria E.
faecalis (ATCC 29212) e suas fases de crescimento. As curvas de crescimento
desta bactéria foram realizada a partir de uma colônia pré-inoculada e incubada durante 12 h, em 5 mL de meio Mueller Hinton (Himedia, Índia), a 37 oC, 220 rpm. Uma alíquota do pré-inóculo (15 µL) foi adicionada a 5 mL de meio Mueller Hinton (Himedia) e incubada a 37 oC, 220 rpm. Deste inóculo, a cada hora foram quantificadas as células totais (por densidade óptica) e viáveis (por inoculação em meio Mueller Hinton ágar) da suspensão bacteriana. A densidade óptica (D.O.) foi analisada por leitura em leitor de microplacas (Bio- Tek PowerWave HT, EUA) a 595 nm com alíquotas de 100 µL da suspensão. O inóculo em meio sólido foi realizado a cada hora pela técnica de microgota, no qual 100 µL da suspensão foi submetido a 10 microdiluições seriadas (1:10) em solução salina (0,85% NaCl) e Tween 20 (0,2%) estéril. A partir das microdiluições, 3 microgotas (2 µL) de cada diluição foi inoculada em meio sólido. As placas foram incubadas de 12 a 24 h, a 37 oC, para contagem de
unidades formadoras de colônias (células viáveis). O crescimento de E. faecalis foi analisado até o período em que a D.O. foi estabilizada. Por fim, foram correlacionados os valores de D.O. e UFC, de acordo com cada hora das curvas de crescimento.
De acordo com a fase logarítmica das curvas de crescimento, a bactéria foi pré-inoculada a partir de uma colônia em 5 mL de meio Mueller Hinton
(Himedia) e incubada até que alcançasse a absorbância de 0,50 – 0,65 a 595 nm. Nesta absorbância, foi considerada uma concentração de 1x1012 UFC.mL-1 para a suspensão bacteriana do pré-inóculo. Desta forma, com o pré-inóculo em fase logarítmica, os bioensaios antibacterianos foram realizados em meio Mueller Hinton (Himedia) com a concentração de 5x104 UFC por poço, em
poços com um intervalo de concentrações das amostras a serem testadas. Os intervalos das concentrações testadas para determinação de uma concentração inibitória mínima ou percentual de inibição de crescimento microbiano foram de 8 a 1024 µg.mL-1 para os peptídeos (clavaninas A e X e
LL-37) e de 128 a 2048 µg.mL-1 para Ca(OH)2. Além das amostras a serem
testadas, foram utilizados 3 controles neste bioensaio: (1) células bacterianas e meio de cultura (100% de crescimento bacteriano); (2) células bacterianas, ampicilina na concentração de 20 µg.mL-1 e meio de cultura (100% de inibição do crescimento bacteriano); e (3) meio de cultura sem bactéria e sem amostras (branco).
Os grupos foram montados em duplicata biológicas e triplicata técnica em placas de cultura de 96 poços (TPP, EUA) incubada por 12 h, a 37 oC, sob agitação média em leitor de microplacas (Bio-Tek PowerWave HT, EUA), com leituras a cada 1 h, a 595 nm. A CIM ou percentual de inibição de crescimento foram determinados a partir dos crescimento microbiano nos pontos da metade da fase logarítmica curvas de crescimento realizadas previamente (abs 0,50 – 0,65), comparados aos controles positivo e negativo. Por fim, todas as concentrações das amostras testadas foram inoculadas por microgota em meio sólido para confirmação de atividade bactericida ou bacteriostática.
5.5. Avaliação citotóxica e imunomodulatória dos peptídeos e do