De konkrete straffbare handlingsalternativene

A comparação do baculovírus selvagem AgMNPV-MP5 com o baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ teve a finalidade verificar a potencialidade do baculovírus recombinante produzido in vitro em relação ao baculovírus selvagem utilizando o mesmo sistema de produção e a mesma multiplicidade de infecção. Além de verificar a produção, foi realizado ajuste polinomial aos pontos experimentais.

A Figura 4.9 mostra o ajuste polinomial aos pontos experimentais da cinética de crescimento celular (células não infectadas e células infectadas). O comportamento da

cinética de crescimento das células infectadas com os baculovírus, selvagem e recombinante, foram semelhantes, haja vista, que foi utilizada a mesma multiplicidade de infecção.

0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 6 7 C é lu la s v iá v e is x 1 0 6 /m L Tempo (dia) Células não infectadas

Células infectadas com AgMNPV-MP5 (Selvagem) Células infectadas com vAgEGT∆-LacZ (Recombinante) Ajuste polinomial de 4ª ordem

Ajuste polinomial de 2ª ordem Ajuste polinomial de 3ª ordem

Figura 4.9 Cinética de crescimento das células não infectadas e infectadas com os baculovírus selvagem e recombinante

A produção de corpos de oclusão foi testada em relação à infecção das células Sf21 com dois baculovírus AgMNPV: selvagem e recombinante. A Figura 4.10 mostra as curvas de produção de OB para os baculovírus AgMNPV-MP5 e vAgEGT∆-LacZ. A produção volumétrica média do baculovírus selvagem AgMNPV-MP5 foi (5,16±0,83)x107 OB/mL e do baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ foi de (5,00±0,80)x107OB/mL.

2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 O B x 1 0 7 /m L Tempo (dia)

Produção de OB - AgMNPV-MP5 (Selvagem) Produção de OB - vAgEGT∆-LacZ(Recombinante)

- - - - Ajuste sigmoidal - AgMNPV-MP5 (Selvagem)

- - - - Ajuste sigmoidal - vAgEGT∆-LacZ(Recombinante)

Figura 4.10 Produção volumétrica de OB da infecção com os baculovírus selvagem e recombinante.

Os valores obtidos a partir das infecções com os isolados, selvagem e recombinante, foram submetidos à análise de variância (ANOVA) para verificar se existe diferença significativa entre as produções dos dois baculovírus, conforme a Tabela 4.4.

Tabela 4.4 Resultado da ANOVA para produção de OB

Baculovírus Média Variância N

AgMNPV-MP5 5,26x107 4,9733x1012 4

vAgEGT∆-LacZ 4,77x107 1,5859x1014 4

F = 0,59318 p = 0,47042

As médias não são significativamente diferentes, com 95% de intervalo de confiança.

Os resultados mostram que não houve diferença significativa da produção dos baculovírus selvagem e recombinante. Isto é um dado importante, uma vez que a capacidade de produção dos baculovírus recombinantes em relação aos seus selvagens é uma característica revelante. Neste cultivo, o fato do recombinante apresentar capacidade similar de produzir OB durante o processo de infecção é um resultado interessante quanto ao processo de produção de bioinseticida viral, pois, utilizando-se menos inóculo, alcança-se potencial semelhante de infectividade do vírus selvagem. A quantidade de inóculo do recombinante vAgEGT∆-LacZ foi 1% (v/v) enquanto para o selvagem AgMNPV-MP5 foi 2,5% (v/v) para que os dois baculovírus apresentassem a mesma MOI.

Os ajustes foram realizados com o auxílio do software Origin 6.0, utilizando-se a Equação sigmoidal de Boltzman que melhor se ajustou aos pontos experimentais. Os resultados dos ajustes estão apresentados na Tabela 4.5.

Tabela 4.5 Ajustes aos pontos experimentais da curva de produção de OB

Baculovirus Selvagem (AgMNPV-MP5)

Baculovírus Recombinante (vAgEGT -LacZ) Produção volumétrica (OBx107/mL) Produção volumétrica (OBx107/mL)

R2 = 0,9886 R2 = 0,9792

A1 = -0,51336 ±0,572 A1 = 0,56562 ± 0,231 A2 = 5,1824 ± 0,124 A2 = 5,2499 ± 0,340 X0 = 3,4213 ± 0,189 X0 = 6,7895 ±0,230

dX = 0,60231± 0,137 dX = 0,70037 ± 0,208

Parâmetros ajustados da Equação de Boltzmann,

Os valores para produção de OB obtidos após o ajuste aos pontos experimentais da infecção com o baculovírus selvagem e recombinante foram semelhantes (COB = (5,18±0,124) x107OB/mL e COB =(5,25±0,34)x107 OB/mL, respectivamente), conforme a Tabela 4.5, comprovados com o teste da análise de variância (ANOVA) (Tabela 4.4), com 95% de confiança, que não identificou diferenças significativas na produção.

Os resultados apresentados demonstram que o baculovírus recombinante é quantitativamente similar em relação à produção in vitro quando comparado com o baculovírus selvagem.

4.4 Conclusão

Com base na cinética de crescimento das células infectadas com as diferentes MOIs verificou-se que os valores obtidos das velocidades específicas de crescimento celular em baixa MOI (1,25; 2,5 e 5,0) foram maiores do que os obtidos em mais alta MOI (12,5; 25,0 e 50,0). Pode-se concluir que ao infectar as células com concentrações mais baixas de inóculo viral, mais células permanecem crescendo mesmo submetidas à ação viral. Isto foi evidenciado pelos valores obtidos das velocidades específicas de crescimento (µx = 1,0223d-1 para MOI 1,25; µx = 0,8425d-1 para MOI 2,5 e µx = 0,6645d-1 para MOI 5,0) que foram mais elevados que os valores das velocidades específicas de crescimento para altas MOIs (µx = 0,4881d-1 para MOI 12,5; µx = 0,4207d-1 para MOI 25,0 e µx = 0,3537d-1 para MOI 50,0). Ainda considerando a cinética, as velocidades médias de infecção e velocidades médias de formação de OB seguiram o mesmo comportamento das velocidades específicas.

A infecção com MOI (5,0) apresentou a maior velocidade de infecção (Ri = (6,13±0,14)x105 células/mL.d) e velocidade de formação de OB (Rp = (5,55±0,82)x106 OB/mL.d). Nesta situação de baixa MOI e altos valores de velocidades médias de infecção e formação de OB, o vírus tem mais possibilidade de infectar, em infecção secundária, aquelas células que ainda não foram infectadas inicialmente. Sendo assim, o valor da MOI igual a 5,0 foi selecionado para o sistema de produção in vitro, utilizando a estratégia de baixa MOI para aumentar a produção de vírus ao longo do processo de infecção.

A infecção que apresentou maior produção de OB aconteceu com MOI igual a 5,0 obtendo-se produção volumétrica de (2,8±0,45) x107 OB/mL em 8 dias de cultivo. Esta MOI equivale a 1% (v/v) do inóculo viral e foi escolhida para realizar os experimentos de bateladas sucessivas.

A estratégia de escolha da melhor MOI para produção in vitro do baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ foi utilizar baixa multiplicidade de infecção (MOI 5,0) para obter a maior concentração de corpos de oclusão gerados no cultivo em suspensão. Após a definição da quantidade de inóculo (1% v/v), foram realizadas bateladas sucessivas para aumentar a produção de OB. Em pelo menos cinco passagens do cultivo, obteve-se quantidade de vírus suficiente para realizar pequena ampliação de escala, a partir de um volume inicial de 1mL de inóculo obter quantidade de (8,9±1,42)x1014 corpos de oclusão para o volume final de reator de 10 m³.

O baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ apresentou boa estabilidade, considerando as análises quantitativas da produção, quando comparado com o baculovírus selvagem AgMNPV-MP5 sem diferenças significativas de produção de OB ao serem submetidos a mesma condição de cultivo.

Capítulo 5

Produção em batelada-alimentada do

baculovírus recombinante vAgEGT∆-

5 Produção em batelada-alimentada do baculovírus recombinante

vAgEGT -LacZ

5.1 Introdução

A crescente demanda de bioinseticidas no mercado nacional, principalmente do baculovírus anticarsia, é incentivadora para busca de alternativas que promovam o aumento na produção. As estratégias de produção tais como batelada, bateladas alimentadas, sistemas em perfusão tornam-se ferramentas indispensáveis para os cultivos in vitro de baculovírus seja para produção de bioinseticidas ou para proteínas recombinantes. Existe um forte interesse no desenvolvimento de processos de ampliação de escala para produção de bioinseticidas baseado no cultivo de células de inseto e subsequente infecção com baculovírus.

A produção in vitro de baculovírus em cultivo de células tem sido abordada em vários trabalhos, tais como: Lua e Reid (2000) com o sistema Helicoverpa armigera NPV em células

Helicoverpa zea, os quais obtiveram uma produção máxima de 1,1x108 OB/mL; Claus et al. (1993) com o sistema Anticarsia gemmatalis NPV em células Spodoptera frugiperda (Sf21), atingiram uma produção de 3x10

7

OB/mL; Kariuki et al. (2000) utilizando o sistema Plutella

xylostella MNPV em células Plutella xylostella, obtiveram a produção de 2,8x106 OB/mL; Bonning et al. (1995), no sistema Autographa californica MNPV em células Sf21, obtiveram uma produção de 6,0x106 OB/mL; Batista et al. (2005), utilizando o sistema Anticarsia

gemmatalis MNPV em células Sf9, que atingiu uma produção de 1,6x107OB/mL e Almeida (2005) com o sistema de cultivo em suspensão do Spodoptera frugiperda MNPV em células Sf9 e Sf21, obteve uma produção máxima de 5x108 OB/mL e 2,5x108 OB/mL, respectivamente. Estes trabalhos mostram sistemas de cultivo em suspensão ou em monocamadas que são essenciais e preliminares para uma futura otimização da produção, pois a partir dos resultados de produção obtidos desses sistemas podem-se obter parâmetros suficientes para otimização e ampliação da produção do produto de interesse.

Estudos têm sido realizados com a finalidade de aumentar e/ou otimizar a produção in

vitro de baculovírus seja para produção de proteínas ou para a produção de bioinseticidas. A

escolha do processo de produção, bem como, o modo de operação dos sistemas de produção é de muita importância para obtenção de altos rendimentos com custo efetivo e visando possível ampliação de escala. Portanto, o modo de operação em batelada alimentada normalmente é utilizado como alternativa para o aumento de produção quando se utiliza o sistema em batelada.

O desenvolvimento de um processo de produção, seja de proteínas recombinantes ou de baculovírus, utilizando células animais exige conhecimento detalhado das suas necessidades nutricionais e de seu comportamento metabólico que podem selecionar uma estratégia de cultivo específico, como batelada, batelada-alimentada ou de perfusão (GIORIA; JÄGER; CLAUS, 2006). Como exemplo, a ausência de produção de subprodutos tóxicos em cultivos bem oxigenados de lepidópteros como linhagens celulares IPLB-SF-21 e Sf9 torna possível utilizar estratégias de alimentação nutritiva, a fim para manter as culturas com elevadas concentrações celulares (NGUYEN et al., 1993; BÉDARD; PERRET; KAMEN, 1997; ELIAS et al., 2000). Inúmeros são os trabalhos que utilizam o cultivo em batelada- alimentada como estratégia de aumentar a produção (WANG et al. 1999; CHIOU; HSIEH; HO, 2000; SITTON; SRIENC, 2008; MERGHROUS et al., 2009). Esse tipo de estratégia é amplamente utilizado para o sistema de expressão em baculovírus, mas para a produção de baculovírus para serem utilizados como bioinseticidas não é comum.

O nível de nutrientes que pode ser adicionado no meio de cultura é restrito à tolerância da célula a alta osmolaridade e ao limite de solubilidade individual dos nutrientes. Os suplementos na batelada-alimentada podem englobar um amplo espectro na nutrição das células de inseto tais como aminoácidos, açúcares (glicose, frutose, manose), lipídeos, vitaminas e fatores de crescimento (CHAN, 1998).

Como estratégia de aumentar a produção de β-galactosidase expressa por baculovírus, Berdád; Perret; Kamen, (1995), utilizando o sistema em batelada-alimentada, fizeram alguns ajustes na fonte de alimentação que normalmente era utilizada para a produção de proteínas recombinantes, ou seja, adicionaram à alimentação maior proporção de yeastolate e também de aminoácidos que promoveram um rendimento 4 vezes melhor na produção de β-

galactosidase quando comparado ao sistema em batelada conduzido com o mesmo tempo de infecção (TOI).

Rotinas de otimização estatística têm sido empregadas para desenvolver uma estratégia de alimentação que aumente a produção de proteínas tais como a β-galactosidase. Esta estratégia envolve a adição simples de nutrientes concentrados (aminoácidos, lipídeos, glicose) aos cultivos de células Sf9 desenvolvidas em meio SF900II SFM (Gibco). Tal suplementação favoreceu o aumento da produção de células Sf9 em cultivos em batelada, atingindo concentração máxima de 3x107 células/mL (CHAN et al., 1998).

Ainda utilizando o cultivo em batelada-alimentada para otimizar a produção de proteínas recombinantes, Chan et al. (1998a) adicionaram uma solução de multicomponentes (extrato de levedura, lipídeos, aminoácidos, vitaminas e glicose) como nutrientes de alimentação para o sistema de produção células/baculovírus (Spodoptera frugiperda (Sf9)/Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV)) com a finalidade de expressar também a proteína β-galactosidase (β-Gal). Esta otimização foi realizada em dois estágios, primeiro foi o procedimento de varredura para determinar as variáveis importantes no sistema, e finalizando com a análise de superfície de resposta do modelo ajustado caracterizando a produção volumétrica de β-Gal. A partir deste estudo, obtiveram uma produção de β-Gal em batelada-alimentada com 2,4 vezes maior do que a produção em batelada simples. Este resultado foi confirmado em análise estatística com os melhores resultados do cultivo em batelada e batelada-alimentada, obtendo-se uma média de produção de 0,5g/L e 1,2g/L de β-Gal, respectivamente.

A utilização de sistemas contínuos de batelada-alimentada estabelece um desenvolvimento de modelos matemáticos confiáveis para fornecer ótimas estratégias de alimentação (NIELSEN et al., 1991). Em cultivos descontínuos de batelada-alimentada, a fonte de nutrientes é geralmente adicionada na cultura em batelada quando o crescimento celular está bem avançado, ou seja, quando as quantidades dos nutrientes estão esgotadas. Esta estratégia garante que o processo de alimentação não aumente indevidamente osmolaridade do meio de cultivo proporcionando maiores concentrações de células (CHAN, 1998).

Visando aumentar a produção da glicoproteína NS1 do vírus da dengue expressa por BEVS, Chan et al. (2002), utilizaram a estratégia da batelada alimentada em cultivos de suspensão com células Sf9 infectadas com baculovírus recombinante do AcMNPV. A batelada alimentada envolveu adição por pulso de alguns nutrientes (aminoácidos, lipídeos, glicose e extrato de levedura ultrafiltrado), no estudo, esta adição proporcionou alta produção de produto intracelular β-galactosidase, a mesma estratégia poderia se aplicada em sistemas que normalmente apresentam baixo rendimento como é o caso da glicoproteína NS1. Os resultados mostraram que as infecções em batelada-alimentada exibiram produção três vezes maior no rendimento da proteína NS1 ao ser comparado com o sistema em batelada.

Diante disto, como estratégia para melhorar a produção dos corpos de oclusão do baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ propõe-se associar o cultivo em batelada- alimentada com a baixa multiplicidade de infecção (Low MOI). A baixa multiplicidade de infecção proporciona um custo menor com a quantidade de inóculo, consequentemente, menos bateladas ou passagens são necessárias para se obter a quantidade mínima de vírus suficiente para infectar uma determinada suspensão celular, promovendo, assim uma economia no custo final de produção (ZHANG; MERCHUK, 2004).

5.2 Metodologia experimental

5.2.1 Células

A linhagem de célula de inseto, Sf21 (American Type Culture Collection, MD) cedidas pela Embrapa/Cenargen, adaptada ao meio de cultura em suspensão (SF900II SFM, Gibco) foi utilizada para a replicação dos baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ. A morfologia, concentração e a viabilidade celular foram monitoradas através de microscopia ótica e a sua manutenção foi realizada em shaker orbital (Tecnal, TE421) com agitação de 120 rpm e

temperatura controlada a 28oC. A concentração celular foi calculada conforme descrito no item 3.2.1 desta tese.

5.2.2 Vírus

Nesta etapa do trabalho foi utilizado o vírus extracelular produzido in vitro do baculovírus recombinante vAgEGT∆-lacZ fornecido gentilmente pelo Dr. Bergmann Morais Ribeiro da Universidade de Brasília.

5.2.3 Solução de alimentação

Para os cultivos em batelada-alimentada foram utilizados três condições de solução de alimentação: somente com nutrientes, com nutrientes e meio de cultura e somente com meio de cultura.

As concentrações dos nutrientes utilizados nos experimentos de batelada-alimentada foram retiradas do trabalho de Chan; Greenfield; Reid (1998). Os nutrientes utilizados para 50mL de suspensão celular foram 2,3mL de Yestolate (50X yeastolate ultrafiltrado, Sigma), 0,55mL de concentrado de lipídeos (100X concentrado de lipídeos, Sigma), 0,35mL de glicose (2,8mM, Vetec), 3,75mL de concentrado de aminoácidos (100X, MEM aminoácidos, Invitrogen) e 1,1mL de glutamina (155,8mM, Gibco). E o meio de cultura utilizado foi o SF900II SFM (Gibco).

5.2.4 Produção em batelada-alimentada

A produção em batelada-alimentada de baculovírus foi realizada através de infecções em células Spodoptera frugiperda, linhagem IPLB-Sf21, com adição (por pulso único) da solução de alimentação. As células Sf21 sadias, apresentando viabilidade de 95% ou superior, foram infectadas com o vírus extracelular (BV) dos baculovírus recombinante

vAgEGT∆-LacZ. As infecções foram realizadas em shaker (120 rpm e 28C), utilizando

frascos erlenmeyers de 250mL, com volume de suspensão de 100mL (razão de aeração igual a 0,4) e com tempo de infecção (TOI) equivalente a 5,0x105 células viáveis/mL, utilizando um inóculo viral com multiplicidade de infecção (MOI) correspondente a 1,25, ou seja, uma quantidade de 0,25% (v/v) de vírus inoculados na suspensão.

Duas suspensões celulares, 100mL cada, foram infectadas com o baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ. A concentração celular foi quantificada diariamente, após atingirem a concentração de alimentação (TOF = 2,5x106 células viáveis/mL). Uma suspensão celular foi dividida em duas suspensões de igual volume (2x50mL) para serem alimentadas com a solução de alimentação composta somente por nutrientes e a outra suspensão celular foi dividida em 4 suspensões de 25mL (4x25mL) onde 2 suspensões foram alimentadas com igual volume de solução de alimentação suplementada com meio SF900II SFM (Gibco) e 2 suspensões celulares foram alimentadas com igual volume (50% v/v) somente com meio SF900II SFM (Gibco). Após alimentação, as infecções foram acompanhadas diariamente para quantificação de células viáveis e produção de OB durante o processo de infecção. Todos os experimentos foram realizados em duplicata.

5.3 Resultados e discussão

A seguir serão mostrados os resultados referentes ao cultivo em batelada-alimentada das infecções com o baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ utilizando as três condições de alimentação com a finalidade de aumentar a produção dos corpos de oclusão produzidos

durante o processo de infecção. Todos os experimentos foram realizados em duplicata, apresentando erro médio de 5% para a contagem das células e 16% para a quantificação dos corpos de oclusão.

In document Straffeloven 2005 §§ 282 og 283. Mishandling av barn i nære relasjoner (sider 32-37)