3.4.1. Obtenção e multiplicação de material vegetal in vitro
3.4.1.1. Embriões somáticos
Embriões somáticos de O. catharinensis foram mantidos em meio de cultura WPM
(Wood Wlant Medium; Lloyd e McCown, 1981), suplementado com sacarose (20 g/L), sorbitol (22 g/L), glutamina (0,4 g/L) e fitagel (Phytagel, Sigma Co., USA) (2 g/L). O pH do meio foi ajustado para 5,8 com NaOH antes da adição do fitagel. Em seguida, os meios foram distribuídos em tubos de ensaio (8 mL/tubo), fechados e autoclavados a 121°C por 15 minutos, a 1,1 Kgf/cm2.
Após 4 semanas de cultivo, os embriões somáticos no estágio globular foram inoculados em novo meio de cultura, para a manutenção das culturas embriogênicas in vitro.
Durante o crescimento e desenvolvimento, os embriões somáticos foram separados por classes de tamanho e morfologia, tendo sido utilizada a seguinte classificação por estágios:
Estágio 1 – Globular (≤ 2 mm)
Estágio 2 – Cotiledonar inicial (2 – 3,5 mm)
Estágio 3 – Cotiledonar intermediário (3,5 – 4,9 mm) Estágio 4 – Maduro (≥ 5 mm)
Os embriões somáticos com 4 semanas de cultivo foram utilizados para a obtenção de extratos que foram avaliados quanto à atividade biológica e para a
caracterização dos metabólitos secundários. 3.4.1.2. Calos
Culturas de calos de O. catharinensis foram mantidas em meio de cultura MS
(Murashige e Skoog, 1962), suplementando com sacarose (20 g/L), ágar (7 g/L), carvão ativado (3 g/L) e o regulador de crescimento ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) (40 mg/L). O pH do meio foi ajustado para 5,8 antes da adição de ágar. Em seguida, os meios foram distribuídos em frascos de cultura tipo “Weathon” (30 mL/frasco) e autoclavados a 121°C por 15 minutos a 1,1 Kgf/cm2. Após 4 semanas de cultivo in vitro, os calos foram
subcultivados para novo meio de cultura, visando a sua manutenção in vitro.
Calos com 4 semanas de cultivo foram submetidos à extração e o extrato foi analisado por CG/EM.
3.4.1.3. Suspensões celulares
Para a obtenção das suspensões celulares, calos com 4 semanas de cultivo foram transferidos para o meio de cultura MS líquido, suplementado com sacarose (20 g/L) e 2,4-D (40 mg/L). O pH do meio foi ajustado para 5,8 antes da autoclavagem a 121°C por 15 minutos, a 1,1 Kgf/cm2.
Após a inoculação, as suspensões celulares foram mantidas sob movimento contínuo em agitador rotatório horizontal a 100 rpm, em sala de crescimento. Estas suspensões celulares foram subcultivadas a cada 15 dias para novo meio de cultura líquido, visando tanto a manutenção in vitro quanto os experimentos de estudo
3.4.1.4. Obtenção da curva de crescimento
A caracterização da curva de crescimento das suspensões celulares foi determinada através da dinâmica de crescimento por volume celular sedimentado (VCS). O VCS foi determinado através da inversão do erlenmeyer, promovendo a sedimentação celular no dispositivo lateral, durante um período de 30 min. Esse volume foi expresso em mL de células/mL de meio de cultura. Foram realizadas leituras em intervalos de dois a cinco dias, sendo iniciadas com a leitura no tempo zero de cultivo e finalizadas aos 30 dias de cultivo. Os dados são mostrados através das médias e desvios padrão e o VCS foi corrigido para o volume inicial de 1 mL.
3.4.1.5. Condições de cultivo in vitro
Os embriões somáticos, calos e suspensões celulares foram mantidos em sala de crescimento com temperatura controlada de 25 ± 2°C, fluxo de fótons de 22 µmol.m2.s-1,
produzido por lâmpadas fluorescentes Phillips TDL, Umidade Relativa de 70% e fotoperíodo de 16 horas de luz.
A B
C D
Figura 3-3. Cultura de tecidos e células de O. catharinensis. A: Embriões somáticos; B:
Calos; C: Suspensões celulares; D: Equipamento utilizado na determinação de volume celular sedimentado (VCS).
3.4.2. Obtenção dos extratos de embriões somáticos, calos e suspensões celulares Foram utilizados dois métodos de extração para a obtenção de extratos dos embriões somáticos. Na primeira, 140 g de massa fresca de embriões somáticos, com aproximadamente quatro semanas de cultura in vitro, foram coletadas e congeladas em
nitrogênio líquido. Esses embriões foram triturados com pistilo e extraídos exausivamente com MeOH.
Devido à quantidade insuficiente da massa do extrato, acumulou-se mais embriões somáticos e repetiu-se a extração utilizando-se um segundo método. Neste segundo método, embriões somáticos (326 g de massa fresca) foram extraídos com 300 mL de MeOH, 300 mL de MeOH/CH2Cl2 (1:2) duas vezes e, posteriormente, com 300 mL de
CH2Cl2, utilizando o aparelho ultra turrax (T25 basic, IKA Labortechnik) a 11.000 rpm
visando a obtenção de material finamente dividido. Os solventes foram reunidos e concentrados com rotaevaporador.
Os calos de O. catharinensis foram coletados e congelados em nitrogênio líquido para posterior análise de metabólitos secundários. Os calos foram extraídos com MeOH, MeOH/CH2Cl2 (1:2) e CH2Cl2, sucessivamente. Os solventes foram reunidos, secos com Na2SO4 anidro, filtrados e concentrados com rotoevaporador. 3.4.3. Fracionamento do extrato dos embriões somáticos
Os extratos dos embriões foram fracionados de acordo com a Figura 3-4, sendo i) primeira extração e ii) segunda extração.
3.4.4. Extração do óleo essencial dos embriões somáticos
Os embriões somáticos 59 g de massa fresca, aproximadamente quatro semanas de cultivo, foram coletados e congelados em nitrogênio líquido. Estes embriões foram submetidos à micro-extração dos óleos essenciais através da destilação por arraste a vapor. Nesse caso não foi possível quantificar os óleos extraídos devido à pequena quantidade obtida, em solução de AcOEt. Assim, o óleo foi diretamente analisado por CG/EM nas condições descritas no item 3.3.6.
Ex. bruto Fr. hexânica Fr. CHCl3 Fr. AcOEt 250 mg 180 mg o Embriões 15 mg 140 gi), 326 g ii) 6 2 mg 11 8 9 90mg Fr. MeOHaq
195 mg i), 1454 mg ii) 110 mg i), 262 mg ii) 83 mg i), 15 mg ii)
20 mg 10 mg 2 3 6 7 5 mg 2 mg 1 mg 3 mg l m n p q Ex. bruto Fr. hexânica Fr. CHCl3 Fr. AcOEt 250 mg 180 mg o Embriões 15 mg 140 gi), 326 g ii) 6 2 mg 11 8 9 90mg Fr. MeOHaq
195 mg i), 1454 mg ii) 110 mg i), 262 mg ii) 83 mg i), 15 mg ii)
20 mg 10 mg 2 3 6 7 5 mg 2 mg 1 mg 3 mg l m n p q
Figura 3-4. Fluxograma de fracionamento do extrato dos embriões somáticos de O. catharinensis.
l: extração com i) MeOH ou ii) MeOH/CH2Cl2;
m: partição com hexano, CHCl3 e AcOEt;
n: coluna de sílica gel eluída com gradiente de hexano/AcOEt; o: coluna flash eluída com gradiente de CH2Cl2/AcOEt/i-PrOH;
p: coluna de sílica gel eluída com gradiente de CH2Cl2/acetona;
q: análise por CG/EM;