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Considerando a estrutura química da ceftazidima, representada na Figura 3, foram realizadas reações para caracterização estrutural do fármaco, principalmente para identificação do anel β-lactâmico (cefalosporina) e da piridina. Porém, uma das etapas

preliminares para os procedimentos analíticos é a degradação hidrolítica do antimicrobiano (MARTÌNEZ; FALCÓ, CABEZA, 2002).

O ensaio de degradação consiste na hidrólise ácida ou alcalina do fármaco quando uma solução aquosa do mesmo é aquecida até ebulição durante cerca de 20 minutos, em meio

___________________________________________________________________________ ácido ou alcalino. Para tanto, foram pesados 20 mg do fármaco e dissolvidos com 10 mL de solução de ácido sulfúrico 4,5 M. A solução foi aquecida até a ebulição em banho-maria durante 20 minutos. Após, arrefeceu-se e neutralizou-se com solução de hidróxido de sódio 6,0 M e o volume foi completado com água destilada em um frasco de 100 mL (MARTÌNEZ; FALCÓ, CABEZA, 2002).

3.2.9.1 Caracterização de cefalosporinas

A literatura destaca vários métodos para determinação de cefalosporinas e outros compostos β-lactâmicos baseados na complexação do reagente com o fármaco, originando

compostos coloridos que podem ser determinados visível ou espectrofotometricamente, como as reações com cloridrato de hidroxilamina, ninidrina, vanadato de amônio, molibdato de amônio, ácido fosfomolíbdico, 2-nitrofenilhidrazina, imidazol, acetilacetonaformaldeído, nitrato de cobalto, cromotrope 2B, sulfato de cério e amônio, íons ferro (III), íons cobre (II), ácido pícrico, 2-dinitrofenol, p-nitrfenol, fenilhidrazina e outros (MARTÌNEZ; FALCÓ; CABEZA, 2002; NAVARRO, LAS PARRAS; GARCIA, 1991; ZUHRI et al., 1994).

Foram selecionadas três reações de caracterização de cefalosporinas: ensaio com íons ferro (III), com íons cobre (II) e com molibdato de amônio.

As soluções foram preparadas com reagentes de grau analítico.

Solução de H2SO4 0,8 M: foram adicionados 48 mL de H2SO4 R em 1,0 L de água destilada.

Solução de H2SO4 25 % (v/v): juntou-se 1 parte de ácido sulfúrico R em 3 partes de água

destilada, sob resfriamento e com as devidas proteções individuais.

Solução de cloreto de cobre 0,005 M: foram dissolvidos 212 mg de cloreto de cobre em 250 mL de água destilada.

Solução de Ferro (III) 0,01 M: foram pesados 4,040 g de Fe(NO3)3.9H2O em 1,0 L de H2SO4

0,8 M.

Solução de molibdato de amônio 2%: foram dissolvidos 20,0 g de molibdato de amônio em 1,0 L de água destilada.

Solução de neocuproína 0,01 M: foram dissolvidos 520 mg de neocuproína em 250 mL de etanol.

Solução de o-fenantrolina 0,02 M: foram dissolvidos 3,965 g de o-fenantrolina em 1,0 L de solução tampão citrato pH 4,2.

Solução tampão citrato pH 4,2: foram dissolvidos 1,910 g de ácido cítrico em 900 mL de água destilada. O pH da solução foi ajustado a 4,2 com solução de NaOH 0,5 M e o volume completado com água destilada para 1,0 L.

Na execução do ensaio, os testes foram realizados em tubos e a identificação baseada na observação visual (aparecimento de coloração ou precipitado).

Na reação com íons ferro (III), em 1,0 mL das soluções da substância de referência e da amostra degradadas, conforme procedimento discutido anteriormente, foram adicionados 1,0 mL de solução de ferro (III) 0,001 M e 0,5 mL da solução de o-fenantrolina 0,02 M. Após, verificou-se o desenvolvimento da coloração produzida.

Na reação com molibdato de amônio, em 10 mL das soluções da substância de referência e da amostra degradadas, conforme discutido anteriormente, foram adicionados 1 mL da solução de H2SO4 25 % (v/v) e 5 mL da solução de molibdato de amônio 2 %.

Procedeu-se ao aquecimento em banho-maria termostatizado durante 30 minutos. Após, arrefeceu-se e verificou-se o desenvolvimento da coloração produzida.

Na reação com íons cobre (II), foram adicionados 1 mL de solução de cloreto de cobre 0,005 M e 1 mL de solução de neocuproína 0,01 M a soluções de ceftazidima a 30 mg/mL preparardas em tampão citrato pH = 4,2. Procedeu-se ao aquecimento em banho-maria durante 10 minutos e arrefeceu-se.

Estes ensaios de identificação foram realizados também utilizando outras amostras de compostos β-lactâmicos, como amoxicilina, ampicilina, cefalexina e cefuroxima, a fim de

comprovar a presença do referido anel β-lactâmico.

3.2.9.2 Caracterização de piridina

Dentre as cefalosporinas comercializadas, a ceftazidima apresenta em sua estrutura química uma molécula de piridina, conforme verificado na Figura 3. Reações específicas de determinação de piridina tornam o ensaio de identificação de ceftazidima seletivo quando

___________________________________________________________________________ comparado com as demais cefalosporinas, uma vez que praticamente todas respondem aos ensaios gerais de identificação (MARTÌNEZ; FALCÓ; CABEZA, 2002).

A literatura destaca a clássica reação da piridina com o reagente cromogênico bromocianogênio na presença de aminas primárias aromáticas, tais como anilina ou o-tolidina, resultando na formação de bases de Schiff coloridas (amarelas), que constituem a base de numerosos ensaios colorimétricos para determinação de piridina e seus derivados (FEIGL, 1966). Destaca ainda a reação da piridina com o bromocianogênio na presença de solução de ácido barbitúrico, resultando em compostos de coloração rósea (JUNGREIS, 1984). Segundo os autores, a reação requer a abertura hidrolítica do anel de piridina com a formação de aldeído glutacônico, o que ocorre imediatamente após a adição de bromocianogênio (Reação 1); o aldeído glutacônico condensa-se com aminas primárias aromáticas (Reação 2) ou ácido barbitúrico (Reação 3), resultando em compostos coloridos (amarelo ou rósea, respectivamente). As reações envolvidas encontram-se descritas abaixo:

Reação 1:

CN-Br + N

+ 2H2O → OH-CH=CH-CH=CH-CHO + NH2CN + HBr

piridina aldeído glutacônico

Reação 2:

OH-CH=CH-CH=CH-CHO + NH2R → RHN-CH=CH-CH=CH-CH=RN + 2H2O

Reação 3: OH-CH=CH-CH=CH-CHO + N H NH O O O → N OH O H OH N N OH O H

aldeído glutacônico ácido barbitúrico composto colorido

As soluções utilizadas foram preparadas em capela com reagentes de grau analítico: Solução de ácido barbitúrico 0,3 % (p/v): foram dissolvidos 300 mg de ácido barbitúrico em água destilada, com auxílio de leve aquecimento e completou-se o volume com água destilada em balão volumétrico de 100 mL.

Solução de anilina 2,5 % (v/v): foram adicionados 2,5 mL de anilina R em etanol R para 100 mL.

Solução de bromo 1 N: foram dissolvidos 10 g de brometo de sódio e 2,80 g de bromato de potássio em 30 mL de água. Juntou-se 1 mL de HCl R e completou-se o volume com água para 100 mL. Preparada em capela.

Solução de bromocianogênio: foi adicionada, gota a gota e sob resfriamento, a solução de cianeto de potássio 5% (p/v) à solução de bromo 1 N até o desaparecimento da coloração amarela. Esta solução deve ser preparada recentemente e armazenada sob refrigeração. Cuidados foram tomados porque é muito tóxico.

Solução de cianeto de potássio 5% (p/v): foram dissolvidos 5 g de cianeto de potássio em água destilada para 100 mL de solução. Preparada em capela.

Na execução do ensaio, os testes foram realizados em tubos e a identificação baseada na observação visual (aparecimento de coloração ou formação de precipitado).

Para a reação com anilina, juntou-se a 2,0 mL de soluções de ceftazidima substância de referência e amostra, previamente degradadas, 0,5 mL de solução de anilina 2,5 % (p/v) e 0,5 mL de solução de bromocianogênio. Verificou-se o desenvolvimento de coloração, através da comparação entre os tubos padrão e amostra.

___________________________________________________________________________ Para a reação com ácido barbitúrico, juntou-se a 2,0 mL de soluções de ceftazidima substância de referência e amostra, previamente degradadas, 0,5 mL de solução de ácido barbitúrico 0,3 % (p/v) e 0,5 mL de solução de bromocianogênio. Verificou-se o desenvolvimento de coloração através da comparação entre os tubos padrão e amostra.