Cross-validation and the Cox model

5.6.1 Concentração de clorofila a

Para as determinações de concentração de clorofila a foi utilizada a metodologia descrita em NUSH et al. (1978). Volumes de 0,5 a 1,0 litro de água coletada na superfície, meio e fundo da coluna d’água dos pontos de coleta foram filtrados sob vácuo, em filtros de fibra de vidro GF/C de 47 mm de diâmetro e 1,2 µm de abertura de poro para retenção do material. Posteriormente os filtros foram armazenados no escuro em frascos com sílica gel e mantidos em freezer até o momento da extração da clorofila. Para a extração utilizou-se como solvente a etanol 80% a quente. Os filtros foram cuidadosamente macerados em almofariz, sob luz reduzida. Após maceração o material foi transferido para tubos de centrífuga em volume final de 10 mL e mantidos em geladeira por 24horas. Após esse período, foi deixado em temperatura ambiente para restabelecimento do equilíbrio térmico por trinta minutos, centrifugado e o sobrenadante i transferido para um balão volumétrico, completando-se o volume para 10 mL. A leitura da absorbância do extrato da clorofila foi determinada utilizando-se um espectrofotômetro da marca Micronal, UV-visível, nos comprimentos de onda de 665 nm, utilizando-se a acetona 90% como referência (branco)

Após a leitura da absorbância da clorofila, procedeu-se à determinação da feofitina, que é um produto da decomposição da clorofila, por meio da acidificação do extrato com solução de

HCl 4N. Após agitação por cinco segundos, a absorbância foi determinada no espectrofotõmetro, nos comprimentos de onda de 665 e 750 nm.

Para o cálculo da concentração da clorofila e da feofitina utilizaram-se as seguintes fórmulas propostas por Golterman et al., (1978).

Clorofila a (µg.l-1) = 11,6* [( Eu663 - Eu750) – (Eu663 - Eu750)] * v/V * 1 Feofitina ((µg.l-1) = 27.9* {[1.7 * ( Ea663 – Ea750) – (Eu663 - Eu750)] * v/V * 1 Sendo que:

Eu = amostra não acidificada Ea = amostra acidificada

v = volume do extrato (em mililitros) V = volume da amostra filtrada (em litros) 1 = comprimento de onda da cubeta

1,7 = razão de rendimento da clorofila não acidificada para acidificada 27,9 = coeficiente de absorção da clorofila em etanol

5.6.2 Comunidade fitoplanctônica

As amostras qualitativas e quantitativas do fitoplâncton dos reservatórios do Baixo rio Tietê foram coletadas com auxilio de uma bomba de sucção, considerando-se amostras obtidas na superfície, meio e fundo da coluna d’água. Para as análises do fitoplâncton total filtrou-se 200 litros de água em rede de plâncton de 20 µm de abertura de malha e estas foram fixadas com formol na concentração final de 4%. Para as análises quantitativas foram retiradas alíquotas de 250 ml do material coletado (não foram utilizadas redes de plâncton), sendo posteriormente fixados em solução de lugol para identificação e quantificação das densidades populacionais fitoplanctônicas.

A análise da composição dos organismos fitoplanctônicos presentes nas amostras foi realizada em lâminas e lamínulas sob microscópio binocular da marca Zeiss® com aumento de até 2000x, equipado com contraste de fase, câmara clara, filtros e equipamento fotográfico. A identificação dos organismos foi realizada segundo as características morfológicas e morfométricas dos mesmos, sendo essa análise efetuada ao menor nível taxonômico possível com

base em bibliografia específica (ANAGNOSTIDIS & KOMÁREK, 1988; KOMÁREK & ANAGNOSTIDIS 1989; 1999 para Cyanophyceae; KOMÁREK & FOTT, 1983 para Chlorococcales; SIMONSEN, 1979 para Bacillariophyceae, BOURRELLY, 1968 para a classe Dinophyceae; BICUDO, 2005 para as demais).

A análise quantitativa do fitoplâncton foi realizada em microscópio invertido, após prévia sedimentação em câmara de Utermohl. Foram utilizadas câmaras de sedimentação que variaram de 15 a 100 mL, com tempo de sedimentação de três horas para cada centímetro de altura da câmara (MARGALEF,1983).

O procedimento de contagem foi realizado por meio de transectos horizontais e verticais, utilizando-se um microscópio invertido da marca Zeiss, modelo Axiovert, com aumento máximo de 1000 vezes. Os indivíduos (células, colônias, cenóbios e filamentos) foram enumerados em campos aleatórios, sendo os resultados expressos em densidade (org.L-1) e calculados de acordo com a fórmula descrita por Ros (1979).

Organismos/mL = (n/sc) (1/h).(F)

Onde: n= número de indivíduos contados;

s=área do campo em mm2 no aumento de 40 X; c= número de campos contados;

h= altura da câmara de sedimentação em mm;

F= fator de correção para mililimitro (10 6 mm3 = 1L)

5.6.3 Comunidade zooplanctônica

Para a análise qualitativa e quantitativa dos organismos zooplanctônicos foram coletados 300 litros de água com uma bomba de sucção marca Sthill, modelo P-835. As amostras foram obtidas na superfície, meio e fundo da coluna d’água. A água foi filtrada em uma rede de 68 µm de abertura de malha e os organismos foram fixados com formol na concentração final de 4%.

Para as análises qualitativa e quantitativa utilizou-se um microscópio estereoscópico da marca Leica® modelo MZ6 com aumento de até 50 vezes e microscópio óptico da marca Zeiss®, com câmara clara e com aumento de até 1000 vezes, ambos com ocular milimetrada.

(EDMONDSON, 1959; SMIRNOV, 1974; KOSTE, 1978; REID, 1985; KOSTE & SHIEL, 1986; SHIEL & KOSTE, 1992; 1993; NOGRADY et al., 1993; SEGERS, 1995; ELMOOR- LOUREIRO, 1997; NOGRADY & SEGERS, 2002; SEGERS & SHIEL, 2003; SILVA, 2003; SILVA & MATSUMURA-TUNDISI, 2005; MATSUMURA-TUNDISI, 2008)

Os organismos foram quantificados considerando-se as diferentes fases de desenvolvimento, isto é, para Copepoda considerou-se as fases de náuplios, copepoditos e adultos ou classes de tamanho no caso de Cladocera (neonatos; jovens e adultos). As contagens de cladóceros e copépodos foram feitas em placas de acrílico quadriculadas sob microscópio estereoscópico, com aumento de 50 vezes. Para os rotíferos e protozoários, subamostras de 1 mL foram contadas em câmara de Sedgewick-Rafter, sob microscópio óptico com aumento de até 1000 vezes.

5.6.4 Índice de Frequência de Ocorrência

A freqüência de ocorrência das espécies foi calculada de acordo com Dajoz (1983) levando-se em consideração o número de amostras onde o organismo ocorreu, em relação ao número total das amostras coletadas (em porcentagem), de acordo com a fórmula a seguir:

F = 100*Pa/P

Onde:

Pa = número de amostragem contendo a espécie; P = número total de amostragens realizadas; F = freqüência de ocorrência.

As espécies foram classificadas em constantes, freqüentes, comuns ou raras, de acordo com os seguintes critérios: