Os métodos aqui apresentados correspondem aos utilizados transversalmente no desenvolvimento deste trabalho para os diferentes produtos descritos. Os métodos que foram utilizados apenas no desenvolvimento de um produto isoladamente serão descritos nesse capítulo, na secção de materiais e métodos.
2.1. Cromatografia de Permeação em Gel (GPC)
A técnica de Cromatografia de Permeação em Gel (Gel Permeation Chromatography – GPC) é uma técnica analítica cromatográfica na qual a separação dos analitos é feita com base no volume hidrodinâmico da molécula. Isto é conseguido através da injecção de uma amostra em solução numa coluna porosa (gel), onde se dá a separação. As moléculas maiores, tendo menor probabilidade de ficar retidas nos poros, atravessam a coluna rapidamente, enquanto as moléculas mais pequenas tendem a ficar retidas na coluna mais tempo.
O GPC é tipicamente aplicado na análise de polímeros. Esta técnica permite obter o peso molecular médio em peso (MW) e a polidispersão. Neste trabalho quando se refere o peso
molecular médio será sempre o MW.
2.2. Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR)
A espectroscopia vibracional é uma técnica utilizada para analisar a estrutura das moléculas através do fenómeno de absorção de radiação pela excitação vibracional das ligações moleculares. As frequências de vibração das ligações moleculares são específicas das ligações
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entre os átomos que as constituem, sofrendo ligeiras alterações condicionadas pelo ambiente molecular em torno dessa ligação. É a absorção de energia a um determinado comprimento de onda que permite identificar a ligação química presente na molécula e, através do cruzamento da informação obtida com os valores de referência conhecidos, identificar a molécula(55).
O FTIR é a técnica de espectroscopia vibracional mais utilizada. A fonte de luz fornece radiação infravermelha em toda a gama de comprimento de onda. Esta luz atravessa um interferómetro, à saída do qual são combinados os dois feixes formados: um feixe óptico fixo e outro com uma combinação de comprimentos de onda que variam ao longo do tempo. No entanto, a informação necessária para a análise da amostra é o espectro para toda a gama de comprimentos de onda, em que a cada comprimento de onda corresponde uma determinada absorção. Assim, a intensidade de luz que atinge o detector é sujeita a uma transformada de Fourier para obter a absorvância a cada comprimento de onda. Esta técnica permite obter informação como se a amostra fosse iluminada por luz monocromática, apesar de ser sempre iluminada por luz policromática(55).
Esta técnica de caracterização química foi utilizada para caracterizar e identificar as amostras em análise. O equipamento utilizado foi um espectrómetro Perkin-Elmer Spectrum 1000 FT-IR.
Todas as amostras analisadas estavam no estado sólido, pelo que foram preparadas em pastilhas de brometo de potássio. As amostras analisadas, assim como o KBr, foram secos pelo menos durante um dia sob vácuo para garantir que a água e outros eventuais solventes seriam removidos. As pastilhas de amostra e KBr foram preparadas numa proporção de peso de 1:10, respectivamente, para uma massa total de 100 mg. Após mistura e trituração num almofariz, a mistura foi transferida para uma prensa para compactação. A amostra foi montada num porta- amostras para pastilhas de KBr. O espectro foi obtido em absorvância num varrimento de 4000 a 400 cm-1.
2.3. Ressonância Magnética Nuclear (H-RMN)
A espectroscopia H-RMN baseia-se na detecção dos desvios químicos dos átomos de hidrogénio de uma amostra exposta a um campo magnético. Quando o campo externo é nulo os dois estados rotacionais de um átomo têm a mesma energia, mas à medida que o campo aumenta a energia dos dois estados rotacionais diverge. A alteração da frequência da radiação que é absorvida e reemitida pelo núcleo quando transita entre dois estados rotacionais depende do ambiente em torno do átomo: os outros átomos aos quais está ligado e a distribuição espacial das nuvens electrónicas. O desvio químico é característico das ligações de um átomo portanto, determinando a que frequência as moléculas absorvem radiação é possível identificar o ambiente químico dos átomos de hidrogénio, e assim identificar as ligações e a estrutura da molécula em torno destes.
Capítulo II - Materiais e Métodos
27 A espectroscopia H-RMN pode ser utilizada para obter o grau de desacetilação do quitosano através da área do resíduo CH3 do grupo N-acetil e da área dos restantes átomos de hidrogénio
na molécula. O grau de desacetilação, DD, é obtido pela Equação 2.1(56).
= 1 − 1 3 1 6 Equação 2.1 Em que:
– integral da intensidade da banda do CH3
– soma dos integrais das intensidade das bandas correspondentes aos protões H2, H3, H4, H5, H6 e H6’
Os espectros de H-RMN foram adquiridos num espectrómetro Bruker 400 (400MHz).
Esta técnica foi utilizada para a determinação do grau de desacetilação do quitosano (DD). A amostra de quitosano foi dissolvida numa solução a 2% (v/v) de ácido clorídrico deuterado em água deuterada, a 70°C.
2.4. Microscopia Electrónica de Varrimento (SEM)
A microscopia electrónica de varrimento permite examinar a superfície de um material com uma grande resolução e com uma grande profundidade de campo. A superfície do material é varrida por um feixe de electrões que aí depositam energia, excitando os átomos do material. No modo mais habitual de construção da imagem topográfica da superfície, os electrões secundários emitidos são detectados e a corrente medida é convertida numa intensidade de um pixel da imagem. A grande profundidade de campo que caracteriza a microscopia electrónica permite ter uma noção da estrutura tridimensional da amostra(55).
Este método foi utilizado para observar a superfície das várias estruturas produzidas. A preparação das amostras para esta técnica passa por garantir que estas se encontram totalmente secas. Para as estruturas em que o resultado final de produção era seco, como as fibras e as matrizes liofilizadas, não foi necessário tratamento adicional. Para o caso de amostras hidratadas ou biológicas foi necessário fixar e desidratar as amostras.
O procedimento adoptado para amostras hidratadas ou biológicas foi a reticulação com glutaraldeído a 2,5% (v/v) em PBS a 4°C durante a noite. As amostras foram depois enxaguadas 3 vezes com PBS durante 2 minutos e depois desidratadas em gradiente em soluções de etanol a 70, 80, 90 e 100%, durante 10 minutos em cada uma.
As amostras foram montadas numa placa de alumínio usando fita adesiva condutora dupla face e revestidas a ouro por pulverização catódica. O equipamento utilizado, a não ser quando indicado o contrário, foi um Zeiss DSM962.
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2.5. Testes de tracção
Os testes de caracterização mecânica foram realizados no equipamento Minimat (Firmware Vsn 3.1). Este equipamento permite realizar testes de tracção a diferentes materiais com a utilização do seu acessório de garras.
Todos os testes de tracção dos materiais desenvolvidos foram realizados a uma velocidade de tracção de 5 mm·min-1. Para todos os testes foram determinadas as dimensões da amostra
utilizada, recorrendo a uma craveira no caso de amostras de liofilizados, cuja secção é um rectângulo, ou com a utilização de um micrómetro para o caso de fibras, com secção circular. As dimensões das amostras foram definidas consoante o tipo de produto, e são mencionadas no respectivo capítulo. Para cada ensaio também foi registado o afastamento inicial entre as garras. Estes testes foram realizados nas condições ambientais do laboratório.
A partir dos dados obtidos por este teste foram adquiridas várias informações consoante o produto em causa, e que serão descritos no capítulo correspondente.
3. Métodos de caracterização biológica