Batching

4.5.3.1 Método imunoistoquímico

Todos os espécimes de CEs de lábio inferior e QAs fixados em formol a 10% e emblocados em parafina, referentes aos casos selecionados para este estudo, foram submetidos a cortes histológicos de 3m de espessura e estendidos em lâminas de vidro, previamente limpas e desengorduradas, preparadas com adesivo à base de Organosilano (3- aminopropyltrietoxy-silano, Sigma Chemical CO, St Louis, MO, USA). Utilizou-se o método da imunoperoxidase pela técnica baseada em polímeros de dextrano (ADVANCETM, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA), utilizando anticorpos monoclonais (hMLH1 e hMSH2). Foram realizadas as etapas laboratoriais descritas abaixo:

o Desparafinação: 2 banhos em Xilol, ambos por 10 minutos à temperatura ambiente; o Álcool etílico absoluto I, II e III – 5 minutos cada à temperatura ambiente;

o Álcool etílico 95ºGL/ 5 minutos; o Álcool etílico 80ºGL/ 5 minutos;

o Remoção de pigmentos formólicos com hidróxido de amônio a 10% em etanol 95º por 10 minutos à temperatura ambiente;

o Lavagem das lâminas em água corrente, 10 minutos; o Água destilada, 2 trocas, 5 minutos cada;

o Recuperação antigênica (Quadro 3);

o Lavagem em água corrente por 10 minutos; o 2 passagens em água destilada (5 minutos cada);

o Duas incubações dos cortes, por 10 minutos cada, em solução de 0,3% de peróxido de hidrogênio em metanol para bloqueio da peroxidase endógena tecidual;

o Lavagem em água corrente por 10 minutos; o 2 passagens em água destilada (5 minutos cada);

o Duas passagens em solução tampão TRIS-HCl (tris-hidroximetil-aminometano, Sigma Chemical, St Louis, MO, USA) pH 7,4, por 5 minutos cada;

o Incubação dos cortes com os anticorpos primários (Quadro 3) diluídos em solução diluente (DakoCytomation – Antibody Diluent with Background Reducing Components – Ref. S3022 – Dako Carpinteria, CA, USA);

o Duas passagens em solução Tween 20 a 1% em TRIS-HCl (pH 7.4), por 5 minutos cada;

o Incubação tampão TRIS-HCl, pH 7,4 (2 passagens – 5 minutos cada); o Incubação do anticorpo secundário + Advance® (DAKO)

o Incubação do complexo estreptoavidina/biotina peroxidase durante 30 minutos à temperatura ambiente;

o Lavagem em solução tampão TRIS-HCl, pH 7,4;

o Imersão em TRIS-HCl, pH 7,4, duas trocas de 5 minutos cada;

o Aplicação do agente cromógeno diaminobenzidina 25 a 30 mg (3,3-diaminobenzidina, Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA), diluída em 100 ml TRIS-HCl, pH 7,4, acrescida de 1,2 ml de peróxido de hidrogênio 10 volumes durante 7 minutos;

o Lavagem em água corrente por 10 minutos; o Passagem em água destilada (2 trocas);

o Contracoloração com Hematoxilina de Mayer por 5 minutos em temperatura ambiente;

o Lavagem em água corrente, 10 minutos; o Água destilada, duas trocas, 5 minutos cada; o Desidratação em cadeia ascendente de etanóis:

o álcool etílico 80°GL (2 minutos) temperatura ambiente; o álcool etílico 95°GL (2 minutos) temperatura ambiente; o álcool etílico absoluto I (5 minutos) temperatura ambiente; o álcool etílico absoluto II (5 minutos) temperatura ambiente; o álcool etílico absoluto III (5 minutos) temperatura ambiente; o Diafanização em dois banhos de xilol:

o xilol 1 (2 minutos); o xilol 2 (2 minutos);

o Montagem lamínula em resina Permount® (Fischer Scientific, Fair Lawn, NJ, USA). O controle negativo consistiu-se na substituição dos anticorpos primários por albumina de soro bovino (BSA – Bovine Serum Albumin) a 1% em solução tampão. Para controle positivo utilizou-se amostras de carcinoma de cólon, considerados pela literatura como padrão de imunomarcação para as proteínas hMLH1 e hMSH2.

Especificidade Clone Fabricante Diluição Recuperação

antigênica Incubação hMLH1 G168-15 Pharmingen (San Diego, CA, USA) 1:200 Tris-EDTA pH 9,0 Overnight (18 horas) hMSH2 G219-1129 Pharmingen (San Diego, CA, USA) 1:200 Sem recuperação Overnight (18 horas)

Quadro 3 Especificidade, clone, fabricante, diluição, recuperação antigênica e tempo de incubação dos

anticorpos estudados.

4.5.3.2 Análise do perfil imunoistoquímico e quantificação das células marcadas

Para a contagem dos casos de QAs não foi feita distinção entre as camadas basal e suprabasal, seguindo o preconizado por Caldeira et al. (2011a) que afirmaram ser mais relevante considerar o epitélio como um todo do que avaliar as camadas epiteliais

separadamente. Os CEs de lábio inferior foram avaliados no “Front” tumoral. Foi preconizado avaliar a região que apresentou maior imunomarcação, para ambas as lesões. Após a coleta dos dados, os mesmos foram devidamente descritos e tabulados (APÊNDICE B e C), objetivando análise comparativa dos resultados obtidos.

Os espécimes corados pelos anticorpos anteriormente mensionados foram avaliados em microscópio óptico (Olympus CH30, Olympus Japan Co., Tokyo, Japão), por dois examinadores devidamente calibrados que avaliaram os casos sem conhecimento de suas gradações (estudo cego). Uma vez examinados, os casos foram avaliados quantitativamente da seguinte forma:

1. Foram avaliados para as QAs o epitélio com graus variados de displasia e para os CEs as células epiteliais neoplásicas Em um aumento de 200x verificou-se a região da lâmina que apresentou mais imunomarcação;

2. O microscópio foi, então, ajustado para um aumento de 400x na região encontrada anteriormente, sendo fotografados dez campos consecutivos de cada caso com auxílio da câmera fotográfica (Infinity 1-3C, Lumenera Co., Ottawa, Canada), acoplada em microscópio de luz (Nikon Eclipse E200MV, Niko Co., Tokyo, Japão), sendo utilizado o programa Lumenera Infinity Analyze (version 5.0.3, Lumenera Co., Ottawa, Canada);

3. Consideraram-se positivas as células epiteliais que exibiram coloração acastanhada em seu núcleo. Com auxílio do programa ImageJ (ImageJ for Mac OS X, vs. 1.44, 64 bit Java), as células positivas e negativas de cada campo foram contadas até atingir um total de 1000 células, com isso os possibilitou-se uma comparação entre os dados das lesões com maior fidedignidade, uma vez que independente da lesão avaliada o valor de células total era o mesmo. Diante da dificuldade de se obter ao término da contagem o valor exato de 1000, optou-se por no último campo avaliado, ao realizar a contagem total do mesmo, fazer uma proporção das células positivas e negativas encontradas em relação às células requeridas para obtenção do total final de 1000 células.

4. Posteriormente, com os dados adquiridos da contagem das células, foi calculado o percentual das células positivas para cada espécime, sendo atribuídos escores segundo Fernandes et al. (2008) (Quadro 4).

Anticorpo Escore Padrão de imunoexpressão Classificação da marcação

hMLH1

0 0% Negativa

1 < 50% de células positivas Expressão reduzida 2 50-75% de células positivas Expressão normal 3 > 75% de células positivas Superexpresssão

hMSH2

0 0% Negativa

1 ≤ 75% de células positivas Expressão reduzida 2 > 75% de células positivas Expressão normal

Quadro 4 Classificação por escore das proteínas proposta por Fernandes et al. (2008).