A cárie e as doenças periodontais, doenças bucais mais prevalentes, são decorrentes de um desequilíbrio da microbiota oral residente, devido ao acúmulo de biofilme nas superfícies dentárias. Tais biofilmes se constituem num agregado de microrganismos embebidos em uma matriz polimérica e fixados às superfícies dentárias através de mecanismos de adesão irreversíveis, caracterizando então, a colonização microbiana nas superfícies dentárias e sua perpetuação no meio ambiente bucal.
O controle freqüente do biofilme dentário, de modo que ele não se torne patogênico, é a medida mais simples e menos onerosa de se controlar ambas as doenças. É uma estratégia preventiva primordial, voltada diretamente ao controle do agente etiológico primário dessas doenças.
Este controle pode ser realizado de forma mecânica ou química. O objetivo do controle mecânico do biofilme é a obtenção de níveis de limpeza capazes de prevenir o início e/ou o desenvolvimento das doenças orais, cárie e doenças periodontais3.
Em alguns casos onde o controle mecânico não está sendo eficaz, lança-se mão do controle químico, que deve ser usado como um coadjuvante aos métodos mecânicos. O controle químico pode ser indicado em algumas situações tais como em pacientes que façam uso de aparelhos ortodônticos fixos que dificultam a remoção mecânica do biofilme; em pós-operatórios de cirurgias orais; em pacientes especiais não habilitados para controle mecânico do biofilme; e em alguns casos de pacientes desmotivados ao adequado controle do mesmo8.
Muitas substâncias têm sido utilizadas no controle químico do biofilme, sejam elas anti- sépticas, antiadesivas e substâncias que promovem a desorganização do biofilme.
Em se tratando de agentes antimicrobianos utilizados no controle químico do biofilme, destacam-se algumas substâncias naturais, dentre as quais, a quitosana. O mecanismo de ação antibacteriano da quitosana está baseado em algumas propostas tais como: interação da quitosana com a membrana das células, alterando a permeabilidade celular; a natureza policatiônica da quitosana, o qual interfere com os resíduos de cargas negativas das macromoléculas de superfície; união da quitosana com o DNA da célula, inibindo a síntese de RNA26; inativação enzimática;
quelação de íons metálicos essenciais e formação de complexos de polieletrólitos nas superfícies bacterianas51.
Tomando como base tais características, este trabalho buscou avaliar a eficácia da quitosana a 0,4% com alto peso molecular e alto grau de desacetilação, incorporada a uma solução para bochecho, sobre a redução de algumas bactérias orais e variáveis clínicas relacionadas ao acúmulo bacteriano, o biofilme visível e o sangramento gengival.
Para tanto, os indivíduos selecionados para a pesquisa fizeram uso do bochecho de quitosana e de um bochecho controle por um período de quinze dias. Anteriormente ao período de bochechos, as unidades formadoras de colônias dos três grupos bacterianos, bem como os índices de placa visível e de sangramento gengival foram avaliados e os resultados demonstraram não haver diferença significativa entre os grupos de bochechos, excetuando-se aqueles obtidos para o ISG (tabela 1 e figuras 7, 8, 9, 10 e 11).
Essa falta de homogeneidade estatística dos grupos em relação ao ISG pode não ter prejudicado a comparação dos grupos nos demais tempos pelo fato dos valores correspondentes a este índice terem sido muito baixo, sem expressão clínica. Como pode ser visto na tabela 1, as médias obtidas em ambos os grupos foram de 1,68 e 0,6% de faces que apresentaram sangramento.
Do mesmo modo que para as variáveis dependentes, quanto às variáveis independentes quantitativas e categóricas os grupos se apresentaram semelhantes (tabelas 2 e 3) antes do início dos bochechos. Esse fato reforça a assertiva de que, caso tivesse havido uma diferença entre os grupos imediatamente após os bochechos e com quinze dias do seu término, esta se devia ao efeito da intervenção e não a estas possíveis diferenças entre os grupos amostrais.
Partindo da premissa que os grupos eram semelhantes antes do início do período dos bochechos no que diz respeito às variáveis dependentes e independentes, serão discutidos a seguir os resultados obtidos a partir do término dos bochechos (tempos zero e quinze).
Do mesmo modo, algumas variáveis relacionadas ao período em que foram feitos os bochechos poderiam ter influenciado os resultados e a atribuição de possíveis efeitos poderia ter sido dada a elas e não ao efeito do bochecho em si. Como evidenciado na tabela 5, não houve diferença significativa entre os grupos para o número total de bochechos e a freqüência de
escovação durante o período em que os bochechos foram realizados, o mesmo sendo observado para as visitas ao dentista neste período. Bem como, as correlações entre o número total de bochechos e a freqüência de escovação nos dois grupos para as variáveis dependentes e independentes não apresentaram correlações significativas. Isso deixa claro que tais variáveis não influenciaram os efeitos dos bochechos sobre nenhuma das variáveis dependentes e independentes analisadas.
Em relação ao número de UFCs do total de estreptococos, os resultados do estudo mostraram que o bochecho de quitosana a 0,4% reduziu significativamente tais valores em relação ao placebo (tabela 4 e figura 7). A princípio poderia se imaginar que a quitosana em solução para bochecho na concentração utilizada neste estudo seria eficaz na redução do total de estreptococos. No entanto, quando se analisou o grupo teste isoladamente (tabela e figura 7), constatou-se que não houve diferença entre os tempos, o que denota uma falta de ação da quitosana sobre esse grupo bacteriano. Caso essa ação fosse real, haveria uma redução imediatamente pós-bochecho que poderia perdurar pelo tempo de observação do estudo (15 dias).
Este resultado vai de encontro à maioria dos trabalhos in vitro pesquisados na literatura, os quais afirmam que a quitosana e seus derivados apresentam ação antimicrobiana sobre estreptococos orais5, 10, 53.
O estudo de Teixeira53 observou in vitro que a quitosana a 0,4% com alto PM e GD obteve ação antimicrobiana sobre S. sanguinis e S. mutans e a quitosana a 0,8% com alto PM e GD apresentou ação antimicrobiana sobre S. sobrinus. Segundo ele, observa-se que para desempenhar ação antimicrobiana sobre algumas espécies de estreptococos, necessário se faz elevar sua concentração, o que in vitro ele conseguiu dobrando-a.
Os demais estudos in vitro apontam para uma redução significativa de espécies de estreptococos orais proporcionada pela quitosana, sejam elas S. sanguinis 10, 53 e S. sobrinus53.
A ação antimicrobiana da quitosana também foi observada em relação a outras bactérias não orais, dentre elas E. coli 17, 23, 34, Helminthosporium 23, P. aeruginosa 19, B. megaterium, B. cereus, S. aureus, L. plantarum, L. brevis, L. bulgaricus, P. fluorescens, S. typhimurium, V. parahaemolyticus 34.
Vale ressaltar que a maioria dos trabalhos sobre a ação antimicrobiana da quitosana foi realizada in vitro e, dessa forma, não consegue reproduzir com verossimilhança a dinâmica do ecossistema oral, não devendo ser utilizado para comparação com o estudo ora desenvolvido.
Ademais, os estudos in vitro verificaram que a quitosana reduziu algumas espécies bacterianas isoladas, como por exemplo, S. sanguinis e S. sobrinus, enquanto, neste estudo a ação antimicrobiana da quitosana foi testada sobre o total de estreptococos orais, o qual representa um gênero que contém várias espécies para as quais os estudos não apresentam resultados.
De todos os estudos que avaliaram o efeito da quitosana sobre bactérias orais, apenas o de Sano e colaboradores43 foi realizado in vivo. Este observou que o bochecho de quitosana a 0,5% com baixo PM e alto GD reduziu as UFCs de S. mutans de dezesseis dos vinte e quatro indivíduos participantes do estudo. Contudo, este estudo utilizou uma metodologia diferente, pois os bochechos de quitosana não foram supervisionados e a contagem das UFCs se deu através do número de bactérias aderidas em tubos de ensaio contendo MSB caldo, transformados em escores.
Do mesmo modo que os estudos in vitro supracitados, esse estudo analisou apenas uma espécie bacteriana e utilizou uma solução de quitosana numa concentração um pouco superior.
Ainda em relação à ação da quitosana sobre as bactérias orais, muitos trabalhos destacam a capacidade de inibição da adsorção bacteriana sobre os estreptococos orais.
De acordo com Sano e colaboradores41, os derivados de quitina inibiram in vitro 70% da adsorção de S. sanguinis e 61% de S. mitis. Tarsi e colaboradores52 observaram que os derivados da quitosana inibiram in vitro a adsorção S. mutans, S. sanguinis, S.gordonii, S.constellatus, S. anginosus, S.intermedius, S. oralis, S. salivarius e S. vestibularis. Os mesmos resultados em relação aos S. sanguinis foram observados por Decker e colaboradores10.
Sano e colaboradores42 verificaram que a quitosana a 0,5% com baixo PM inibiu in vitro a aderência dos estreptococos orais durante três horas. Reforçando essa ação antiadesiva, Sano e colaboradores44 afirmaram que a quitosana de baixo PM inibiu 70% da adsorção bacteriana e aquela com alto GD inibiu 90% da adsorção de S. sobrinus e 70% dos já aderidos.
Apesar da ação antiadesiva da quitosana ter sido testada sempre in vitro, o fato dela existir poderia suscitar o fato de que a mesma poderia impedir a colonização das superfícies dentárias in
vivo ou mesmo desalojar bactérias já aderidas, contribuindo para redução nos níveis dessas bactérias na boca e, conseqüentemente, a redução do biofilme e sangramento gengival.
Ainda se tratando de estreptococos, este estudo também avaliou a ação antibacteriana da quitosana sobre uma espécie isolada, S. mutans. Após o uso do bochecho de quitosana a 0,4%, não foi observada diferença entre este grupo e o que bochechou a substância placebo (tabela 4 e figura 8). Quando da comparação entre os tempos para o grupo teste, observou-se um aumento estatisticamente significativo das UFCs para esta bactéria (tabela 7 e figura 8). O aumento no número das UFCs desta bactéria pode ser devido ao consumo de uma dieta cariogênica a base de sacarose, o que não pode ser confirmado, uma vez que a variável dieta não foi avaliada neste estudo. Diante destes dados, pode-se afirmar que o bochecho de quitosana a 0,4% não apresentou ação antimicrobiana sobre o S. mutans, o que contrasta com os estudos in vitro5, 53 e com o estudo de Sano e colaboradores43.
A relação da capacidade antiadesiva in vitro da quitosana sobre o S. mutans é relatada em alguns trabalhos41, 51, 52. Sano e colaboradores41 verificaram que o derivado da quitina inibiu a adsorção de 82% dos S. mutans. Corroborando esse achado, Tarsi e colaboradores51, observaram que, na presença de saliva e sacarose, a quitosana reduziu, em torno de 47 a 67%, da fixação do S. mutans a hidroxiapatita, destacando que a saliva restaura as propriedades adesivas do esmalte. E Tarsi e colaboradores52 afirmaram que a quitosana com baixo PM apresentou inibição estatisticamente significativa da fixação dos S. mutans a superfície dentária e que este biopolímero reduziu de 30 a 90% da aderência dessa espécie bacteriana às células epiteliais da bochecha.
Como não foi observado efeito antibacteriano da quitosana utilizada neste estudo em relação ao total de estreptococos e ao número de UFCs de S. mutans, a repopulação por estas bactérias não pode ser observada. Nesse sentido, os resultados desse estudo confirmam esse achado. Conforme observado na tabela 6, quinze dias após os bochechos os grupos não diferiram em relação a estas bactérias, o mesmo tendo sido observado quando se comparou os grupos em relação a ambas bactérias após o término dos bochechos e quinze dias após (tabelas e figuras 7 e 8).
Poderia ser questionado então o porquê do uso de uma concentração de 0,4% de quitosana, uma vez que o efeito obtido no outro estudo in vivo foi por uma concentração de
0,5%43 e que alguns estudos in vitro53 apontam para concentrações também maiores como inibidoras da adsorção e bactericidas. Como a concentração de 0,4% era muito próxima àquela utilizada no único estudo in vivo e pelo fato da concentração bactericida mínima sobre biofilmes para duas espécies representativas de estreptococos orais obtida por Teixeira53 ter sido de 0,4%, optou-se pela verificação de sua eficácia clínica.
Outro gênero bacteriano analisado neste estudo foram os lactobacilos orais. Os resultados mostraram que o bochecho de quitosana a 0,4% não apresentou eficácia antimicrobiana sobre esse grupo bacteriano quando comparado ao grupo controle (tabela 4, figura 9), nem quando o grupo teste foi analisado sozinho nos diferentes tempos (tabela 7 e figura 9).
As pequenas flutuações observadas nos níveis de lactobacilos nesse estudo podem ter sido oriundas do elevado consumo de carboidratos fermentáveis pela população aqui acompanhada ou por variações comuns no grau de recuperação dessas bactérias. Ainda, os níveis de lactobacilos orais estão bastante sujeitos a variações a depender de áreas de aprisionamento físico presentes na boca27, que nem sempre são passíveis de controle em uma pesquisa clínica. Esse fato pode ser ilustrado pelo que aconteceu com o grupo controle, cujos números de UFCs aumentaram após os bochechos e quinze dias após voltaram a cair (tabela 8 e figura 9).
A falta de ação sobre os lactobacilos orais também pode ter sido fruto da inacessibilidade dos bochechos às áreas retentivas onde essas bactérias costumam se localizar, cicatrículas e fissuras e áreas lisas não livres como as interproximais27. Como não houve ação da quitosana sobre os lactobacilos, sua repopulação que seria verificada quinze dias após o término dos bochechos não pode ser observada (tabelas 7 e 8 e figura 9).
Este resultado diverge do trabalho de Teixeira53 que observou que a quitosana com alto PM e alto GD a 0,8% reduziu as UFCs do L. casei. Contudo, cumpre salientar que este estudo foi realizado in vitro e que a quitosana reduziu as UFCs do L. casei numa concentração maior do que 0,4%, a utilizada neste estudo. Provavelmente, então, uma concentração mais elevada seria necessária para ter efeito sobre os lactobacilos orais.
Uma outra abordagem realizada nesse estudo foi a eficácia dos bochechos sobre as variáveis clínicas índice de placa visível e sangramento gengival.
No que se refere aos resultados encontrados nesta pesquisa para o IPV, constatou-se que houve uma redução da média deste índice da LB para o T0 e deste para o T15 (tabela 7, figura 10),muito embora uma redução de 11,54% para 6,65% não tenha significado clínico algum. Este fato pode ser justificado pelo efeito mecânico do bochecho e pelo efeito Hawthorne que os autores definem como uma melhora na higiene oral devido à participação do aluno na pesquisa25, o que pode também ser constatado em relação ao grupo controle que apresentou uma mesma tendência de declínio no acúmulo do biofilme (tabela 8 e figura 10).
Entretanto, as freqüências de escovação iniciais e finais entre os dois grupos testados não apresentaram diferença significativa (tabelas 2 e 5), o que poderia nos levar a crer que tal efeito não estava associado a uma melhoria na escovação. Há que se pontuar que esta é uma variável referida pelo aluno, estando sujeita ao viés da informação. Nesse sentido, outro aspecto que se deve levar em consideração é o fato da qualidade da escovação ter melhorado, apesar de não ter havido nenhuma orientação de escovação.
Não pode ser deixado de lado, ainda, o fato dos alunos apresentarem uma boa condição de higiene oral, visto que o IPV antes do experimento (11,54%) foi considerado baixo. Assim, pode- se concluir que o bochecho de quitosana a 0,4% não alterou o biofilme visível e, portanto, seu efeito após quinze dias também não foi influenciado pelos bochechos em si (tabelas 7 e 8 e figura 10).
Os resultados deste estudo em relação ao IPV divergem do trabalho de Sano e colaboradores45, onde o bochecho de quitosana fosforilada a 0,5% com baixo PM e alto GD, reduziu 26% do biofilme novo e 61% do biofilme envelhecido. Porém, além da quitosana ter sido fosforilada, algumas críticas podem ser feitas a esse estudo. Este trabalho in vivo utilizou uma amostra bastante pequena, visto que apenas três indivíduos participaram do experimento; o bochecho formulado continha 10% de etanol, podendo a redução do biofilme observada ter sofrido influência do álcool; e, além disso, o uso dos bochechos não foi supervisionado, não se tendo a certeza se os bochechos foram realizados apenas uma vez ou realizada sobretratamento.
Dentro desta mesma perspectiva, outro estudo clínico realizado por Sano e colaboradores43, também diverge dos resultados encontrados nesta pesquisa em questão, na medida em que o bochecho de quitosana a 0,5% com baixo PM e alto GD, reduziu significativamente os escores do índice de Quigley & Hein em 11,1% e do ISP em torno de
25,8%. Todavia, esse bochecho foi formulado com 15% de etanol e essa redução dos índices QHI e ISP pode ter sido devido a concentração do álcool e não da quitosana presente no bochecho.
No que se refere à ação do bochecho de quitosana a 0,4% sobre o ISG, pode-se observar que houve uma redução deste índice ao longo do tempo (tabela 7, figura 11), porém considerada não significativa. Logo, o bochecho de quitosana não alterou o ISG. Um discreto aumento foi observado no ISG após o período de bochechos no grupo controle, acompanhado de uma similar redução após quinze dias (tabela 8 e figura 11).
Os efeitos observados sobre o ISG podem ser atribuídos aos mesmos motivos já relatados para o IPV. Poderia ser levantada, ainda, a hipótese de que essa redução não foi efetiva, uma vez que os valores do ISG para ambos os grupos já eram muito baixos. Sem dúvida, uma redução de médias de 1,68% para 1,08% no grupo teste e incremento de 0,6% para 0,71% no grupo controle não expressam elevação e redução efetivas.
Não foram encontrados trabalhos na literatura pesquisada que contemplassem a ação da quitosana sobre o ISG. Dessa forma, bases comparativas não são oferecidas para os resultados aqui encontrados.
Outro aspecto que deve ser discutido diz respeito às características da quitosana, PM, GD e concentração do biopolímero. Neste estudo, foi constatado que o bochecho de quitosana a 0,4% com alto PM e alto GD não apresentou redução sobre os três grupos bacterianos avaliados, bem como, sobre o IPV e ISG.
Divergindo deste aspecto, Teixeira53 observou in vitro que a quitosana a 0,4% com alto PM e alto GD apresentou ação antibacteriana sobre S. mutans e S. sanguinis e a 0,8% sobre S. sobrinus e L. casei. Liu e colaboradores26 verificaram que quanto maior o PM e o GD maior a ação antimicrobiana deste biopolímero. No e colaboradores34 e Zheng e Zhu54 afirmaram que quanto maior o PM maior a ação bactericida sobre bactérias gram positivas.
Nos dois estudos in vivo, Sano e colaboradores45 e Sano e colaboradores43, verificaram que a quitosana a 0,5% com baixo PM e alto GD reduziu 26% do biofilme novo, 61% do biofilme envelhecido e 11,1% dos escores do QHI e 25,8% do ISP, respectivamente, portanto, sendo efetivo na redução do biofilme divergindo dos resultados aqui relatados.
Outro aspecto abordado sobre a quitosana, é sua capacidade de neutralizar o pH do biofilme através da ligação deste biopolímero, carregado positivamente, aos ácidos, carregados negativamente, provenientes do metabolismo bacteriano. A quitosana restabelece o pH a valores normais, mantendo o pH do biofilme neutro.
Neste sentido, Shibasaki e colaboradores48, 49 realizaram dois estudos que corroboram essa ação antiácida da quitosana. Um destes estudos observou, in vitro, que uma goma de quitosana a 1 e 3% com baixo PM foi eficaz na neutralização do pH do biofilme na presença de carboidratos fermentáveis49.
No outro trabalho, constatou-se que a quitosana de baixo PM reduziu a queda do pH do biofilme na presença de sacarose para 5,0. Foi observado também que este biopolímero não influencia a atividade glicolítica de S. mutans, pois seu efeito sobre a inibição da queda do pH é devido a capacidade tampão da quitosana de neutralizar os ácidos e penetrar no biofilme48.
Outro aspecto analisado nesta pesquisa é a relação entre a atividade antimicrobiana da quitosana e o pH da solução. Muitos trabalhos afirmam que a solução de quitosana com baixo pH apresenta maior ação antibacteriana17, 19, 26, 34.
Nesta pesquisa, o pH final da solução de quitosana foi 6,5. Isto pode ter diminuído a ação antimicrobiana da quitosana devido a sua pobre solubilidade, assim como mostra alguns estudos discutidos a seguir.
Consoante Jia, Shen e Xu17, a solução de quitosana com baixo pH apresenta grupo NH2
protonado favorecendo a interação com a superfície negativa bacteriana, dessa forma, aumentando a capacidade bactericida da mesma. Este autor também afirmou que o ácido acético exerceu ação antibacteriana e quanto menor o pH da solução de quitosana menor a CIM.
Liu e colaboradores26 observaram que quanto maior o pH da solução de quitosana, menor a solubilidade do biopolímero e menor ação antibacteriana deste. Confirmando esse aspecto, Jumaa, Furkert e Müller19 verificaram que a solução de quitosana com valores de pH maior do que 5,5 causaram precipitação da quitosana dissolvida. NO e colaboradores34 afirmaram que quanto menor o pH da solução, maior a atividade bactericida da quitosana.
Outro aspecto relatado sobre a ação antimicrobiana da solução de quitosana pode também ser devido à concentração do ácido na solução.
Nesse estudo foi usada uma concentração de ácido acético em que a quitosana fosse completamente diluída. Dessa forma, foi usado ácido acético a 0,3%, e essa baixa concentração também pode ter diminuído a solubilidade do biopolímero e conseqüentemente a ação antimicrobiana da quitosana contida no bochecho.
Nesse aspecto, No e colaboradores34 mostraram que o ácido acético foi efetivo na inibição