A produção da proteína recombinante em quantidade e na ausência de contaminantes se faz necessária para a realização dos estudos espectroscópicos propostos neste trabalho. Para tal, a síntese da proteína HS100A12 foi conduzida em E. coli, cepa Rosetta e induzida por IPTG, conforme protocolo descrito na seção 4.3.7.
A expressão da proteína foi monitorada por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 16% em tampão tricina (Figura 21), onde são observadas bandas de expressão adicionais frente ao conteúdo de proteínas totais de E.coli. A presença da proteína HS100A12 é confirmada pela banda em aproximadamente 10,57 kDa. 1 2 3 kDa 16,9 14,4 10,7 6,21 8,15 1 2 3 1 2 3 kDa 16,9 14,4 10,7 6,21 8,15 1 2 3 kDa 16,9 14,4 10,7 6,21 8,15 1 2 3
Figura 21 - Expressão da proteína HS100A12. Proteínas visualizadas em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE
16%) em tampão tricina. Colunas: 1- marcadores de massa molecular; 2- cultura antes da indução e 3- cultura induzida com 1 mM de IPTG após 5 horas a 370C. A posição da HS100A12 está indicada
pela seta vermelha.
4.4.1.1 Expressão dos Mutantes da Proteína HS100A12
Primeiramente, foi realizado teste de expressão de cada mutante da proteína HS100A12 e confirmadas as melhores condições para a produção de grande
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quantidade e estabilidade da proteína para, então, procedermos com a expressão em maior escala (2 litros). Os procedimentos utilizados para realizar o teste de expressão e a expressão foram os mesmos para todos os diferentes mutantes da proteína.
Os testes de expressão foram feitos em células da cepa Rosetta de E. coli inoculadas em 10 mL de meio LB e induzidas pela adição de solução 1 mM de IPTG. O nível de expressão das proteínas recombinantes foi avaliado retirando-se alíquotas de hora em hora das culturas de células mantidas nas temperaturas de 30oC e 37oC (dados não mostrados).
Todos os precipitados (“pellets”) provenientes das alíquotas retiradas durante a etapa de expressão protéica foram adequadamente ressuspendidos e preparados para análises por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE. As frações dos mutantes A80C e F57C/A80C foram escolhidas para efeito de ilustração, pois todos os mutantes da proteína apresentam resultados de expressão similares.
Na figura 22, é apresentado o gel eleforético de poliacrilamida do teste de expressão a 37oC dos mutantes A80C e F57C/A80C da proteína HS100A12, evidenciando a existência de frações induzidas com o tamanho esperado para a proteína (aproximadamente 10,5 kDa). As frações induzidas nessa temperatura por 5 horas revelam a existência de maior quantidade de proteína tanto para o mutante A80C quanto para F57C/A80C. Com isso, optamos por expressar estes e todos os outros mutantes em 2 L de meio LB, a 37oC por 5 horas, como descrito para a proteína nativa (seção 4.3.7.), obtendo-os em quantidade e estáveis para posterior purificação. kDa 16,9 14,4 10,7 6,21 8,15 1 2 3 4 5 6 7 8 kDa 16,9 14,4 10,7 6,21 8,15 1 2 3 4 5 6 7 8
Figura 22 - Expressão dos mutantes A80C e F57C/A80C a 370C. Proteínas visualizadas em gel SDS- PAGE
16% em tampão tricina. Colunas: 1- marcadores de massa molecular; 2- amostra não induzida; 3- Mutante A80C induzido a 370C por 2 horas; 4- Mutante A80C induzido a 370C por 5 horas; 5-
Mutante A80C induzido a 370C “overnight”; 6- Mutante F57C/A80C induzido a 370C por 2 horas; 7- Mutante F57C/A80C induzido a 370C por 5 horas e 8- Mutante F57C/A80C induzido a 370C
“overnight”. As posições dos mutantes da proteína HS100A12 estão indicadas pelas setas vermelhas.
4.4.2 Purificação da Proteína HS100A12
O protocolo inicial de purificação da proteína HS100A12 nativa foi adaptado do procedimento utilizado por Moroz et al (75), onde fazia-se uso de duas etapas cromatográficas, sendo a primeira, uma cromatografia por interação hidrofóbica, seguida por uma cromatografia de troca iônica. Contudo, o intenso manuseio da amostra para a retirada do excesso do sal NaCl após a etapa de eluição da coluna de interação hidrofóbica levou à precipitação da proteína. Com isso, o sucesso esperado não foi alcançado com o uso do protocolo original, sendo necessário que estabelecéssemos um novo procedimento, descrito ao longo desta seção, para obtermos a proteína pura.
A purificação da proteína HS100A12 inicia-se incubando o sobrenadante que resultou do rompimento das células (extrato bruto) com CaCl2 que, em seguida, é aplicado na coluna de interação hidrofóbicaHiprep Fenil-Sefarose FF e eluída com tampão contendo EDTA. A incubação com CaCl2 é necessária pois, como mencionado na introdução deste capítulo, o íon Ca+2 provoca mudanças conformacionais na proteína HS100A12, expondo seu interior hidrofóbico e com isso, aumentando a interação da proteína com a resina.
A análise dos resultados (Figura 23) indica que esta etapa de purificação foi importante para retirar uma grande parte de contaminantes do material bruto, mas não foi suficientemente eficiente para purificar a proteína, exigindo a utilização de uma segunda etapa cromatográfica. A escolha desta segunda etapa se baseou na observação de que a maioria dos contaminantes presentes na amostra possuía pesos moleculares maiores que a proteína de interesse, assim levando-nos a decidir por uma cromatografia de exclusão molecular, em que se separa as moléculas por diferença de tamanho. Com isso, a proteína HS100A12 eluída da primeira etapa de purificação foi aplicada à coluna Superdex 75 e o resultado foi a obtenção da proteína em quantidade e grau de pureza suficientes para as medidas espectroscópicas (Figura 23).
78 1 2 3 4 5 6 7 8 9 kDa 16,9 8,15 10,7 6,21 1 2 3 4 5 6 7 8 9 kDa 16,9 8,15 10,7 6,21
Figura 23 - Purificação da proteína HS100A12 por cromatografia de interação hidrofóbica e de exclusão molecular. Proteínas visualizadas em gel SDS- PAGE 16% em tampão tricina. Colunas: 1-
marcadores de massa molecular; 2- amostra induzida; 3- amostra não induzida; 4- pellet; 5- fração solúvel das células lisadas; 6- material que não se ligou à coluna Fenil Sefarose; 7- amostra da proteína de interesse eluída da coluna Fenil Sefarose; 8- fração que compõem um dos picos do cromatograma de exclusão molecular e 9- amostra da proteína eluída da coluna Superdex 75. A posição da proteína HS100A12 está indicada pela seta vermelha.
4.4.2.1 Purificação dos Mutantes da Proteína HS100A12
As etapas cromatográficas empregadas na purificação dos mutantes da proteína HS100A12 foram similares àquelas padronizadas para obtenção da proteína nativa, exceção feita à adição do reagente 1,4-Ditiotritol (DTT) nos tampões de todas as etapas da purificação. Esta modificação foi introduzida no protocolo de purificação dos mutantes para evitar a formação de pontes dissulfetos entre os resíduos de cisteína inseridos pelas mutações.
Assim como para a proteína nativa, o nível de pureza obtido para todos os mutantes foi bastante adequado com variações apenas em termos de rendimento, que foi muito pequeno para alguns mutantes em estudo.
Na figura 24 são apresentados os géis eletroforéticos (SDS-PAGE 16% em tampão tricina) dos mutantes A80C, F57C/A80C e K33C/A80C para efeito de ilustração, pois todos os mutantes da proteína apresentam o mesmo perfil de purificação. A presença dos mutantes da proteína HS100A12 é confirmada pela banda em aproximadamente 10,575 kDa.
1 2 3 4 5 6 7 8 kDa 16,9 14,4 10,7 6,21 1 2 3 4 5 6 7 8 kDa 16,9 14,4 10,7 6,21 1 2 3 4 5 6 7 1 6, 9 14 ,4 10 ,7 8,1 5 6,2 1 KDa 1 2 3 4 5 6 7 1 6, 9 14 ,4 10 ,7 8,1 5 6,2 1 KDa A B 1 2 3 4 5 6 7 8 kDa 16,9 14,4 10,7 6,21 1 2 3 4 5 6 7 8 kDa 16,9 14,4 10,7 6,21 1 2 3 4 5 6 7 1 6, 9 14 ,4 10 ,7 8,1 5 6,2 1 KDa 1 2 3 4 5 6 7 1 6, 9 14 ,4 10 ,7 8,1 5 6,2 1 KDa A B
Figura 24 - Análise por eletroforese em SDS-PAGE 16% em tampão tricina da purificação dos mutantes da proteína HS100A12. (A): Mutante A80C. Colunas: 1- marcadores de massa molecular; 2-
amostra induzida; 3- amostra não induzida; 4- pellet; 5- fração solúvel das células lisadas; 6- material que não se ligou à coluna Fenil Sefarose; 7- amostra do mutante eluída da coluna Fenil Sefarose e 8- amostra da proteína eluída da coluna Superdex 75. (B): Colunas: 1- marcadores de massa molecular; 2- material não ligado à coluna Fenil Sefarose; 3- amostra do mutante F57C/A80C eluída da coluna Fenil Sefarose; 4- amostra do mutante F57C/A80C eluída da coluna Superdex 75; 5- material não ligado à coluna Fenil Sefarose; 6- amostra do mutante K33C/A80C eluída da coluna Fenil Sefarose; 4- amostra do mutante K33C/A80C eluída da coluna Superdex 75. As posições da proteína HS100A12 estão indicadas pelas setas vermelhas.
4.4.3 Influência dos Íons Cálcio e Zinco no Estado de Oligomerização da