A espetrometria de massa é uma das mais importantes técnicas de análise estrutural da atualidade, devido à sua rapidez de análise, elevada sensibilidade, baixo limite de deteção (geralmente na ordem dos picogramas e picomoles) que tornam esta técnica bastante versátil e permitem a sua aplicabilidade nas mais diversas áreas da ciência, como química, biologia, ciências forenses, entre outras. Através da espetrometria de massa é possível determinar a massa molecular e quantificar moléculas e biomoléculas, através da sua ionização e fragmentação dos iões formados, de forma a elucidar a sua estrutura e confirmar a sua identificação [87].
1.9.1 Espectrómetro de massa
Um espectrómetro de massa moderno típico é composto essencialmente por cinco componentes (Figura 19):
Sistema de introdução da amostra, por introdução direta ou introdução da amostra proveniente de um método separativo;
Fonte de ionização que permite a ionização da amostra em fase gasosa; Analisador de massa que separa os iões consoante a sua razão massa/carga; Detetor no qual o fluxo de iões é convertido num sinal elétrico;
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Sistema de aquisição de dados que faculta a obtenção do espetro de massa, a partir do qual temos a abundância relativa dos iões que chegaram ao detetor em função da razão massa/carga.
Figura 19: Esquema dos principais componentes de um Espectrómetro de Massa.
Todo o processo, desde a fonte de ionização até ao detetor, é realizado sob alto vácuo de modo a evitar colisões entre os iões e o gás de fundo, de forma a impossibilitar a ocorrência de reações ião-molécula.
De entre as técnicas de ionização, as mais comuns são a Ionização Eletrónica (EI), a Ionização Química (CI), a Ionização por desadsorção laser assistida por matriz (MALDI) e a ionização por electrospray (ESI) e os analisadores mais vulgares são o quadrupólo, a armadilha de iões (ion trap), o de tempo de voo (TOF) e ainda o de ressonância ciclotrónica de iões com transformada de Fourier (FTICR) [88]. Na presente dissertação, utilizou-se um espectrómetro de
massa equipado com uma fonte de ionização por electrospray (ESI), um analisador de armadilha de iões (ion trap) e um multiplicador de eletrões como detetor. No multiplicador de eletrões onde a corrente iónica é multiplicada por aceleração de eletrões na superfície de um elétrodo, originando eletrões secundários. Deste modo, é transmitido um sinal elétrico, que chega ao sistema de aquisição de dados que, por sua vez, o exibe na forma de um espectro de massa [89].
1.9.1.1 Princípios básicos da ionização por Electrospray (ESI)
A ionização por electrospray (ESI) é uma das principais técnicas de ionização à pressão atmosférica, que permitiu expandir a análise de uma vasta gama de moléculas que podem ser
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analisadas por espetrometria de massa, incluindo moléculas de elevada polaridade, elevada massa molecular, não voláteis e de grande complexidade estrutural. Esta técnica apresenta características que a tornam distinta das outras técnicas de ionização, como a capacidade para produzir iões multiplamente carregados (com número de cargas elevado) o que, uma vez que a sua razão massa carga é reduzida, possibilita a análise de compostos de massa molecular elevada, até centenas de kDa. Uma vez que as amostras são introduzidas em solução, possibilita o acoplamento com técnicas de separação, como por exemplo o HPLC e, visto ser uma técnica de ionização suave, a ESI permite que as interações não covalentes que existem na fase líquida sejam preservadas na fase gasosa [87].O princípio de electrospray foi inicialmente descrito em 1968 por Dole e seus colaboradores, que consideraram a possibilidade de gerar iões provenientes de macromoléculas da fase líquida para a fase gasosa através da pulverização de uma solução contida na ponta de um capilar carregado eletricamente. A partir destes estudos, em 1988 John Fenn, que em 2002 seria consagrado com Prémio Nobel em Química, aplicando este princípio à espetrometria de massa [90]. Na Figura 20, encontra-se esquematizado o processo
de electrospray.
Figura 20: Esquema do processo de ionização por Electrospray [91].
No processo de ionização por ESI uma solução diluída do analito, é bombeada a um fluxo bastante baixo (0,1 - 10 μL/min) através de um capilar, ao qual foi aplicado uma voltagem (2- 5kV) e, consoante o potencial aplicado, a carga das gotículas pode ser positiva ou negativa. Quando é aplicado, por exemplo, um potencial positivo, os iões positivos tendem a afastar-se para uma região menos positiva, ou seja, na direção do contra-elétrodo [92]. Assim, a gota que
se forma na extremidade do capilar está enriquecida com iões positivos, e à medida que a densidade de carga na gota aumenta, o campo elétrico formado pelo capilar e contra elétrodo
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aumenta, provocando a deformação da gota que se encontra na extremidade do capilar, adquirindo a forma de um cone que é conhecido por cone de Taylor, Figura 20. Quando as repulsões de Coloumb na superfície carregada superam a tensão superficial da solução, atinge- se o limite de Rayleigh, pelo que as gotas que contêm excesso de carga, positiva ou negativa, desprendem-se do capilar subdividindo-se sob a forma de um spray. Sucessivas divisões das gotículas com remoção de moléculas de solvente, potenciada pela interação com o gás contra corrente, geralmente azoto, levam à formação de iões não solvatados em fase gasosa [92], [93], [94]. Em seguida, através de um cone/orifício, os iões passam para uma zona intermédia
mantida a uma pressão mais baixa e atravessam o skimmer em direção ao analisador de massa que se encontra a alto vácuo. No skimmer os iões mais leves (moléculas de gás e solvente) são bombeados enquanto que os iões da amostra passam através dele [92], [94].
1.9.1.2 Analisador de Massa de Armadilha de Iões (Ion Trap)
O analisador de armadilha de iões é composto por dois elétrodos end cap, com superfícies hiperbólicas, e por um elétrodo de anel central (Figura 21).
Figura 21: Esquema Ion Trap [95].
Além da elevada sensibilidade, uma das vantagens do analisador de armadilha de iões é que permite fazer experiências de espectrometria de massa tandem no tempo, isto é, os iões percursores são mantidos no interior da armadilha, enquanto os outros são ejetados. Os iões percursores são sujeitos a um campo de radiofrequências que os detêm numa posição estática no analisador (sistema de 3 elétrodos, dois endcaps e um elétrodo de anel central) e são então bombardeados com gás (normalmente Hélio) de forma a fragmentarem [96]. Os fragmentos
resultantes são ejetados, por aplicação de voltagens nos elétrodos endcap, em direção ao detetor. A remoção dos iões indesejáveis é conseguida pela aplicação de voltagens que levem à sua colisão com as paredes do analisador [95], [96].