Concepts

Foi descrito neste trabalho a caracterização do gene PRP1 (ABCC7) de L. major que codifica uma proteína transportadora pertencente à família de transportadores ABC. Esse gene foi isolado por clonagem funcional através de metodologia descrita por Cotrim, Garrity e Beverley (1999). Como se sabe, a pentamidina é um composto de segunda linha utilizado na terapêutica da leishmaniose, sobretudo de casos que apresentam resistência ao tratamento convencional a base de antimônios. Devido ao pouco conhecimento sobre o mecanismo de ação da pentamidina no parasita, foi proposto o isolamento de genes relacionados com a resistência, a partir de bibliotecas genômicas que têm a capacidade de superexpressão extracromossomal dos genes clonados no vetor cosmídeo cLHYG por indução do aumento do número de cópias, considerando que a amplificação gênica constitui um importante mecanismo de resistência à drogas em Leishmania (BEVERLEY, 1991; SEGOVIA, 1994; BORST; OUELLETTE, 1995; OLMO et al., 1995). Assim, utilizando esta estratégia, foram isolados os cosmídeos cosPen1-A e cosPen1-B, pertencentes ao mesmo locus (Fig. 1), capazes de conferir resistência à pentamidina. A caracterização do locus foi feita a partir de deleções através de digestão parcial com as enzimas de restrição HindIII e EcoRV e posterior subclonagem e sequenciamento de nucleotídeos (Fig. 1) (COELHO, 2002; COELHO; BEVERLEY; COTRIM, 2003). Através dessa análise foi identificado que o trasportador ABC PRP1 era capaz de conferir resistência à pentamidina quando transfectado e amplificado seu número de cópias no parasito, o primeiro descrito envolvido na resistência a esse composto em Leishmania.

Discussão A análise molecular do gene PRP1 de L. major mostrou que esse gene é de cópia única (Fig. 2), dado de acordo o Projeto Genoma de L. major. Esse gene está localizado no cromossomo 31, um cromossomo de 1.500 kb (LEPROHON, 2006). Além do gene PRP1 (ABCC7), estão localizados nesse mesmo cromossomo os genes dos transportadores ABC, PGPE (ABCC4), PGPD (ABCC5) e ABCC6, todos eles membros da subfamília ABCC e provavelmente originados por eventos de duplicação gênica (LEPROHON et al., 2006). Nenhum dos 8 membros dessa subfamília apresentam ortólogos nos parasitos do gênero Trypanosoma, T. brucei e T. cruzi (LEPROHON et al., 2006), com exceção da MRPA (ABCC3) de T. brucei envolvida na resistência ao melarsoprol (SHAHI; KRAUTH-SIEGEL; CLAYTON, 2002). O gene PRP1 encontra-se conservado em outras espécies do gênero Leishmania, inclusive em L. braziliensis, a única espécie do subgênero Viannia analisada neste estudo (Fig. 5, Fig. 6, Fig. 8 e Tab. 5), demonstrando esse transportador ABC ser específico do gênero Leishmania. Iniciadores degenerados assim como sondas específicas de diferentes regiões do gene PRP1 detectaram a presença de tal gene nas espécies estudadas. Tal estratégia já foi demonstrada em Leishmania e T. brucei e é capaz de detectar seqüências de nucleotídeos relacionadas com esses transportadores (HENDERSON et al., 1992; LÉGARÉ; HETTEMA; OUELLETTE, 1994; MASER; KAMINSKY, 1998). Somente em L. chagasi, os iniciadores degenerados não amplificaram seqüências relacionadas ao gene PRP1 (Fig. 5), embora os experimentos por Southern blot com sondas específicas desse gene, indicaram que o gene PRP1 está presente nesta espécie (Fig. 8). Diferenças nas seqüências de nucleotídeos dos genes das diferentes espécies podem explicar a dificuldade de obtenção do respectivo fragmento de DNA. Para exemplificar esse fato, os iniciadores PRP1F2 e PRP1R2 dirigidos para o gene

Discussão

PRP1 de L. major amplificavam um fragmento específico a partir de DNA genômico de L. amazonensis assim como de L. major, mas não em L. infantum (dados não mostrados). Dentre as seqüências de aminoácidos do 1º domínio de ligação de ATP do transportador PRP1 das espécies estudadas, foi observada uma identidade de cerca de 80% (Tab. 5 e Fig. 6). Já entre as seqüências do transportador MRPA, foi encontrada uma identidade média de 75% entre os membros analisados, neste caso 6 espécies de Leishmania e T. brucei (Tab. 6 e Fig. 7). Em ambos os casos, observa-se que o domínio de ligação de ATP dos transportadores ABC mostram-se bastante conservados, conforme já descrito por outros autores (HIGGINS, 1992; LEPROHON et al., 2006).

A análise por Northern blot indicou a presença de transcritos do gene PRP1 apenas nos transfectantes promastigotas pSNBR/8 kb SmaI-A e cosPEN1-A, mas não nos parasitos selvagens de L. major (Fig. 3). No primeiro transfectante foram detectadas duas bandas: uma de 6 kb, tamanho suficiente para codificar a PRP1, e uma de cerca de 4,4 kb (Fig. 3A). Transcritos de tamanho incompatível, além daquele da fase de leitura predita, já foram observados em mutantes e transfectantes contendo DNAs circulares em várias espécies de Leishmania (KAPLER; BEVERLEY, 1989; KAPLER; ZHANG; BEVERLEY, 1990; HENDERSON et al., 1992; KATAKURA et al., 1999; WONG; CHOW; WIRTH, 1994). Já os transfectantes contendo o cosmídeo cosPEN1-A apresentaram um único transcrito, maior do que 10 kb (Fig. 3B). Os dados apresentados estão de acordo com o observado por outros autores que mostram que a detecção de transcritos de transportadores ABC por Northern blot são raramente detectados em promastigotas selvagens, devido aos baixos níveis de expressão desses genes (OUELLETTE; FASE-FOWLER; BORST, 1990; HENDERSON et al., 1992; PAPADOPOULOU et

Discussão al., 1994; CHIQUERO et al., 1998; ANACLETO et al., 2003; PARODI-TALICE et al., 2003; KATAKURA et al., 2004; ARAUJO-SANTOS et al., 2005). Mesmo considerando a ausência de transcritos para os respectivos transportadores ABC MDR1 e MRPA por Northern blot em parasitos selvagens (HENDERSON et al., 1992; PAPADOPOULOU et al., 1994), os mutantes nulos para os respectivos genes apresentaram um aumento na suscetibilidade às respectivas drogas: vinblastina (MDR1) e os antimonias (MRPA) (DODGE et al., 2004; PAPADOPOULOU et al., 1996), indicando que esses transportadores são expressos e funcionais em parasitos selvagens. Resultados prévios do knockout de um dos alelos do gene PRP1 em formas promastigotas de L. infantum, também mostrou um aumento da suscetibilidade à pentamidina nesses parasitos. A geração de mutantes nulos para o gene PRP1, seria de grande valia para uma melhor compreensão do papel desse transportador ABC no metabolismo em Leishmania assim como na suscetibilidade à pentamidina e aos antimonias trivalentes os quais a PRP1 confere resistência cruzada.

Em ensaios por RT-PCR utilizando iniciadores internos ao gene PRP1, produtos específicos foram detectados tanto em parasitos selvagens quanto em diferentes transfectantes promastigotas de L. major (Fig. 3C). Esses mesmos iniciadores foram capazes de amplificar fragmentos específicos de cerca de 600 pb correspondendo aos transcritos do gene PRP1 de formas promastigotas de outras espécies de Leishmania (Fig. 9A). Transcritos a partir de formas amastigotas de lesão por L. amazonensis também foram detectados por RT-PCR, utilizando iniciadores internos que correspondem ao 1º domínio de ligação de ATP da PRP1 (Fig. 9B). Além disso, quando utilizado oligodT para a síntese de cDNA, transcritos do gene PRP1 foram detectados por RT-PCR em formas promastigotas e

Discussão amastigotas de L. major o que indica a presença de transcritos maduros em ambos os estágios evolutivos do parasito (Fig. 9C). Leprohon et al. (2006) demonstraram resultados similares por DNA microarray em L. infantum, cuja expressão do gene PRP1 ocorre em ambos os estágios evolutivos embora não haja uma expressão diferencial significante para esse gene. Apenas o gene ABCF3 apresentou maior expressão na forma promastigotas enquanto que os genes ABCA3, ABCG3 e ABCF2 estão superexpressos nas formas amastigotas (LEPROHON et al., 2006). No entanto, o papel desses transportadores ABC no metabolismo do parasito ainda é incerto (LEPROHON et al. 2006). Interessantemente, não foi observada nenhuma regulação diferencial entre os dois principais estágios evolutivos, para os membros da família ABCC conhecida por fornecer proteção a um grande número de substâncias endobióticas e xenobióticas (DEELEY; WESTLAKE; COLE, 2006), dos quais um membro está envolvido na proteção a xenobióticos, a MRPA (ABCC3) (CALLAHAN; BEVERLEY, 1991; PAPADOPOULOU et al., 1994; LÉGARÉ et al., 2001b) além da PRP1 (ABCC7) conforme descrito neste estudo.

Os experimentos por Western Blot utilizando soro policlonal anti-GST-PRP1 detectaram em extratos de membrana de L. major a presença de uma proteína de cerca de 180 kDa em transfectantes que superexpressam a PRP1, assim como em parasitos selvagens. O tamanho da banda corresponde ao peso molecular predito da seqüência de nucleotídeos (COELHO, 2002; COELHO BEVERLEY; COTRIM, 2003). Esses dados vêm a confirmar uma baixa expressão desses transportadores ABC em parasitos selvagens em nível protéico, como observado em Leishmania para a MRPA (ABCC3) (LÉGARÉ et al., 1997), MDR1 (ABCB4) (CHIQUERO et al., 1998) e LtrABC1.1 (ABCA8) (PARODI-TALICE et al., 2003) e em T. brucei para a

Discussão MRPA (ALIBU et al., 2006), o que indica que os transportadores ABC são funcionais e devem exercer um papel importante na suscetibilidade à drogas em Leishmania.

5.2 Papel do transportador ABC PRP1 na resistência à pentamidina em