Transplante isogênico
A avaliação da rejeição do enxerto de intestino fetal no transplante isogênico mostrou que não houve rejeição.
Transplante alogênico
Avaliação da rejeição do enxerto de intestino fetal no transplante alogênico após sete dias de seguimento, realizada segundo critérios estabelecidos por Auber et al. 26, mostrou que houve menor rejeição nos enxertos submetidos aos tratamentos. O PCI-R reduziu a rejeição quando comparado ao grupo ALO-Tx, porém o tratamento com Tacrolimo em associação com o PCI-R ou não preveniu de maneira mais eficiente a rejeição
quando comparados com o ALO-PCI (Figura 24).
Figura 24 - Rejeição do enxerto de intestino fetal no transplante alogênico (ALO) após sete dias de seguimento, avaliados segundo os critérios de Auber et al. 26. ALO-Tx, transplantado sem tratamento; PCI, transplantado submetido ao PCI-R prévio; FK, transplantado tratado com Tacrolimo. *, P<0,05 vs. ALO-Tx; #, P<0,05 vs ALO-PCI.
0 5 10 15 20 25
ALO-Tx ALO-PCI ALO-FK ALO-PCI-FK
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# 0 5 10 15 20 25ALO-Tx ALO-PCI ALO-FK ALO-PCI-FK
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4. DISCUSSÃO
O presente trabalho mostrou que o PCI-R interfere nos processos de desenvolvimento e de rejeição aguda do enxerto de intestino fetal. Nos enxertos isogênicos mostrou efeito benéfico, promovendo aumento da quantidade de células caliciformes e redução da ocorrência de apoptose. Quando adicionado o tratamento de Tacrolimo, houve maior escore de desenvolvimento do enxerto, evidenciado pelo aumento da proliferação celular, aumento da quantidade de células caliciformes e redução importante de apoptose. Do mesmo modo, nos enxertos alogênicos tratados com Tacrolimo, o PCI-R promoveu aumento do desenvolvimento e redução importante da rejeição.
A contribuição fundamental desta pesquisa foi o efeito benéfico do PCI-R sobre o intestino transplantado, tanto de forma isogênica como alogênica. Esses efeitos evidenciados no modelo de transplante de intestino são inéditos e extremamente relevantes, uma vez que podem trazer contribuições efetivas na compreensão da evolução do enxerto intestinal pós-transplante.
O escore de desenvolvimento do enxerto, descrito por Auber et al 26, considera a presença de epitélio digestivo, vilosidades, criptas, camada muscular e importância da secreção mucosa. O prejuízo observado no escore de desenvolvimento promovido pelo PCI-R em enxertos isogênicos pode ser devido à dilatação cística do enxerto, consequente ao expressivo acúmulo de muco no interior da luz do intestino. Este acúmulo pode ser decorrente principalmente de dois fatores: aumento de células caliciformes, promovendo maior quantidade de secreção, e ausência de estoma neste modelo de transplante, comprometendo o aspecto das vilosidades na mucosa, resultando em menor escore de desenvolvimento. Assim, em condições de dilatação cística, como ocorreu neste grupo, a avaliação por escore pode ser subestimada empregando os critérios estabelecidos por Auber et al 26. Isto indica que ao se realizar estudos com avaliação mais prolongada a confecção de estomias faz-se necessária.
Experimentalmente, o emprego do camundongo como modelo de transplante de intestino delgado para estudos imunológicos aumentou desde a
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década de 90 27 por oferecer vários recursos e vantagens experimentais como a disponibilidade de linhagens (congênicas, isogênicas, transgênicas e knockouts) com características imunológicas únicas, além das tecnologias disponíveis (anticorpos monoclonais e sondas para a biologia molecular) e o custo do animal e de sua manutenção 27,28. Algumas limitações estão relacionadas a esse modelo animal, tais como desenvolvimento das habilidades microcirúrgicas, diâmetro vascular diminuto, intensidade de rejeição do camundongo menor (fígado, rins) do que no rato, podendo subestimar o processo de rejeição, apresentando uma sobrevida do enxerto mais variável.
O transplante intestinal fetal apresenta boa reprodutibilidade e facilidade técnica de ser realizado, em ratos e camundongos, de forma avascular 29. Apesar da imaturidade do sistema imune e o baixo poder imunogênico do tecido fetal 30, o modelo de transplante de intestino fetal é aplicável para estudos referentes à modulação da resposta imunológica alogênica 25,26,31.
A ausência de mesentério, que faz parte desta técnica de transplante com um enxerto intestinal livre e um número diminuído de células T na placa de Peyer do intestino fetal do camundongo implica numa menor quantidade de células imunocompetentes, que pode ser agravado com a destruição decorrente da isquemia 25,26,32,33,34. Entretanto, a resposta de rejeição aguda alogênica mostrou-se semelhante àquela induzida pelo tecido adulto em camundongos 26,31, apesar de uma reação alogênica mais amena ter sido observada em ratos 32. Além disso, este modelo é válido para estudo dos fenômenos imunológicos induzidos pelo aloenxerto, ou seja, não ocorre diminuição da imunogenicidade do enxerto, com desenvolvimento normal dos enxertos em 85% dos casos transplantados de maneira isogênica e 100% de rejeição quando transplantados de maneira alogênica 26. O presente estudo corrobora o relato de Auber et al. 26, uma vez que houve perda completa do enxerto na ausência de imunossupressão no transplante alogênico e ausência de rejeição do enxerto isogênico.
Rezende et al. 33 mostraram um desenvolvimento progressivo dos enxertos até o 5° PO, ainda que em níveis inferiores para o alogênico. Em seguida, observava-se o processo de rejeição aguda mais importante do que o processo de desenvolvimento. O transplante do tecido intestinal fetal alogênico é um excelente modelo para estudos do processo de rejeição aguda, pois esta
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rejeição desencadeada pode ser controlada pelo Tacrolimo, permitindo o desenvolvimento normal do enxerto intestinal 35.
O modelo de transplante de intestino fetal em camundongos tem-se mostrado um bom modelo para avaliação da imunogenicidade do enxerto, assim como da sua modulação 26,31. Outro modelo de transplante intestinal avascular foi descrito por Ogasa et al 36 em ratos recém-nascidos, que foi usado para avaliação da preservação hipotérmica do intestino comparando duas soluções de preservação. Em estudos prévios em nosso laboratório, o modelo de transplante de intestino fetal foi utilizado para avaliação do processo de desenvolvimento e rejeição do enxerto em condições isogênica e alogênica
33,37,38,39 e para avaliação da imunomodulação pelo gangliosídeo no processo
da rejeição 37,38. Por outro lado, em nosso laboratório, também, vem sendo estudado o PCI, como forma de modulação da lesão de IR, e o PCI-R, em órgãos como fígado 40, intestino 11,13 e, mais recentemente, no transplante avascular de ovário 24,41.
Além da rejeição sabe-se que as consequências da isquemia em diferentes tecidos dependem da duração e que muitas das lesões são desenvolvidas durante o estágio de reoxigenação decorrente da reperfusão tecidual 21,42. As mitocôndrias são alvos importantes dos danos provocados pelos processos de IR como diminuição das atividades da nicotinamida adenina dinucleotídeo ligada com hidrogênio desidrogenase, do carreador de adenosina difosfato/adenosina trifosfato (ADP/ATP) e da ATP sintetase, além do aumento na atividade da fosfolipase A2 43.
Ocorre ainda, acentuado acúmulo de cálcio e aumento da geração de radicais livres pelas mitocôndrias. A associação destes eventos pode ser responsável pelas lesões e morte celular, decorrente da reperfusão, possivelmente por um fenômeno de transição de permeabilidade da membrana mitocondrial 44.
Em 1984 pesquisadores utilizando miocárdio de coelhos, mostraram que um período curto de isquemia, prévio à isquemia cardíaca sustentada, produzia um efeito protetor contra a lesão cardíaca de IR 45, porém, o termo PCI foi introduzido na literatura por Murry et al. 46 e significa indução de um curto período de isquemia seguido por curto período de reperfusão antes de um período mais longo de isquemia. Os autores descreveram o efeito benéfico
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deste procedimento sobre o tamanho da área de infarto causado por isquemia sem PCI, resultados semelhantes foram descritos por outros autores 47.
O mecanismo de manutenção da respiração celular, a diminuição da produção de espécies reativas e a preservação da integridade e do funcionamento das membranas celulares, por meio de diversos mediadores estão sendo estudados como prováveis mecanismos de ação do PCI 17,18. O PCI confere proteção tecidual possivelmente por melhorar a resistência celular à hipóxia reduzindo as necroses e as apoptoses decorrentes da isquemia e do intenso estresse oxidativo que decorre da reperfusão. Também reduz o consumo das reservas celulares de ATP, a concentração de catabólitos durante a isquemia sustentada, além da expressão de fatores desencadeantes de apoptose (como fator de necrose tumoral alfa, interleucina-1 beta e espécies reativas de oxigênio) e reduz o metabolismo das mitocôndrias 48,49.
O PCI promove na reperfusão uma menor conversão da xantina desidrogenase para xantina oxidase em diversos tecidos, diminuindo a produção de ânion superóxido, protegendo os tecidos da lesão durante a fase da reperfusão 50 e suas conseqüências como a redução da peroxidação lipídica em tecido pulmonar medida através de seu produto malondialdeído 51. Também tem sido descrito induzir um menor consumo de ATP e inibição da glicólise, levando a um menor acúmulo de lactato e íon hidrogênio 11,52,53. O PCI também melhora o equilíbrio iônico e ácido-base, reduzindo o acúmulo intracelular de íons sódio e a acidose 54.
A manutenção dos níveis de ATP e fosfato de creatina, em conjunto com a redução da taxa de demanda energética pela célula tem-se mostrado como uma hipótese central no mecanismo de ação do PCI no que se refere à respiração celular 46,52,55,56,57,58. Parece haver, durante os períodos de isquemia do PCI, uma diminuição dos depósitos de glicogênio, sendo a glicólise diminuída no período isquêmico sustentado 18.
Por induzir menor condutância ao íon potássio na membrana, leva a uma situação denominada de repouso de membrana, com uma inibição metabólica que permite a célula ser mais tolerante a hipóxia 59. Parece ainda induzir uma redução na demanda energética durante a isquemia. No coração verificou-se que o PCI ativa canais de potássio sensíveis ao ATP na
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mitocôndria, regulando os níveis de ATP e cálcio 60. A mitocôndria tem papel fundamental na geração de espécies reativas de oxigênio, homeostasia do cálcio e liberação de fator indutor de apoptose. Assim, o PCI é capaz de reduzir a morte celular 61.
O conceito do PCI tem sido estendido a diferentes órgãos e tecidos surgindo como estratégia de proteção entre órgãos contra os efeitos deletérios da IR aguda 21. A repercussão sistêmica do PCI pode também atenuar a lesão à distância causada pela IR, este processo é chamado de PCI-R ou PCI à distância e não é limitado a um órgão ou sistema. Este mecanismo possui duas fases de proteção contra a lesão endotelial, uma precoce (curta, de até 4 horas) e outra tardia (mais prolongada, de 24 a 48 horas de duração), sendo ambas mediadas por ativação do sistema nervoso autônomo 55,62.
Em 1993, Przyklenk et al.63 descreveram um mecanismo de proteção cardíaco com uso de breves períodos de isquemia em território distante da área de infarto. Posteriormente, Liaw et al.64 observaram que a isquemia de um grupo muscular protegeu o membro contralateral.
Estudos subseqüentes mostraram que existia também uma proteção interórgãos, além do intra-órgão já descrita. Gho et al.65 mostraram que a isquemia transitória do músculo esquelético conferia proteção ao miocárdio. Embora os mecanismos de proteção à distância não sejam completamente conhecidos, sugere-se o envolvimento de um amplo espectro de supressão da sinalização inflamatória, que inclui também modificação da expressão gênica.
Kimura et al .66 mostraram que na prática clínica o PCI-R promove aumento da vascularização endotelial, podendo ser uma técnica simples, segura e viável para proteção endotelial de vasos periféricos, já sendo considerado de uso seguro e útil em cirurgias eletivas de coração, fígado e pulmão 21,67.
O PCI atenua a lesão de IR no fígado e no intestino, estendendo esta proteção aos pulmões 40,68, quanto ao seu efeito sobre a vascularização, o PCI promoveu angiogênese com subseqüente melhora da função do miocárdio após oclusão coronária, evidenciado pelo aumento da densidade capilar/ arteriolar 69.
Embora os mecanismos de proteção à distância não sejam completamente conhecidos, os efeitos do PCI-R, por oclusão da artéria
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mesentérica superior, parecem ocorrer via estímulo neuro-sensorial pela bradicinina, o que não se observa quando o PCI é realizado diretamente no órgão 22. Outro mecanismo proposto seria via supressão da sinalização inflamatória, como observado em leucócitos circulantes humanos após três ciclos de PCI em membro superior 23.
O método usado para avaliar a proliferação celular, a imunohistoquímica para o PCNA, está baseado na expressão deste antígeno na fase G1 tardia e durante a fase S do ciclo celular. A escolha do anticorpo monoclonal anti-PCNA deveu-se à facilidade de se poder trabalhar com tecido fixado em parafina, ser resistente a fixação em formol, apresentar uma meia vida longa de aproximadamente vinte horas, indicando que o núcleo pode permanecer positivo mesmo após o estímulo 70.
Em nosso estudo observou-se que o PCI-R no enxerto isogênico promoveu aumento de células caliciformes e redução da morte celular por apoptose. Por outro lado, na presença de Tacrolimo, o PCI-R estimulou a proliferação celular no enxerto isogênico e o desenvolvimento dos enxertos isogênico e alogênico.
Mais recentemente, estudos avaliando os mecanismos intracelulares pelo qual o PCI protege os tecidos da lesão de IR tem sido conduzidos e apresentam resultados controversos. Tanto na isquemia quanto na reperfusão promovem aumento de ocorrência de apoptose nos diferentes tecidos estudados. No coração, a ativação do NF kappa B se relaciona à ocorrência de apoptose 71. Na mucosa intestinal, a IR promove disfunção da respiração mitocondrial via formação de espécies reativas de oxigênio, em conseqüência, há intensa oxidação da glutationa mitocondrial, aumento da peroxidação lipídica mitocondrial, redução do potencial membrana mitocondrial e aumento da liberação do citocromo c da mitocôndria que culmina na ativação da caspase-9 e caspase-6 72.
No coração e no intestino, o PCI não interfere na expressão de NF kappa B, mas eleva a expressão de Bcl-2, um gene antioxidante, com propriedade antiapoptótica, e este aumento se correlaciona inversamente com a ocorrência de apoptose e protege o tecido
da peroxidação lipídica
71. O
PCI também previne do acúmulo de xantina/hipoxantina
73, reduz o
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